稳定株构建 FAQ.pdfVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 稳定株构建 FAQ(慢病毒包装) 1 ，什么是瞬时转染和稳定转染 ？ 答 ：瞬时转染 ：顾名思义 ，外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非 常低 ，所以以染色体外(episomal)形式存在 ，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑 到细胞分裂会稀释质粒的量 ，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降 低的过程 ，且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染 ：是相对瞬时转染而言 ，进入细胞的质粒整合入细胞基 因组中 ，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中 ，质粒表达稳定 ，拷贝数低 ，且能实现诱导表达。稳定转染 并不是一种与瞬时转染不同的方法 ，只是对瞬时转染的细胞进行筛选 ，得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因 基因传递的方法而异 ，跨度可以从 10-8到 10-1。因此 ，对于有的转染方法 ，比如化学试剂介导的转染 ，其整合几 乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布 ，依据不同的基因传递方法 ，呈现不同的靶向倾向性 ， 所以是一种半随机整合。不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表 XXXX。 2 ，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些 ？ 答 ：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有 ： 1) ，外源插入片段的拷贝数。多数情况下 ，低拷贝甚至是单拷贝可以减少 人为实验因素的干扰。 2) ，整合的几率 ，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度 ，而且还可以帮助 人们更容易得到混合稳定株。 3) ，整合位点的转录活跃度 ，决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理 想的状况是单拷贝 ，但转录活性比较高。 4) ，整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定 性 ，有些区域易发生重组或者丢失 ，从 而导致稳定株再次丢失的情况。 5) ，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合 往往伴随这插入失活宿主内源基因 ，所 以实验时通过使用混合稳定株 ，或者对多个单克隆稳定株进行比较 ，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 3 ，什么时候需要稳定细胞株 ？ 答 ：以下实验 ，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求 ： 1) ，外源片段在分裂细胞中长期(2周)稳定表达。虽然普通转染实验一般只能保证 2-4 天的转染和表达效率 ，但腺 病毒载体在多数分裂细胞中可以维持 2-4 周内的高转染效率和表达周期。而非分裂细胞 ，可以使用腺相关病毒载体 转导外源基因 ，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达 1年的高效表达。 2), 需要构建使用诱导表达系统 ，这主要是由于 ： a.过表达基因或者干 扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素; b.目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。 3), 希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数 ，以避免引入人为因素影 响实验结果的精确性。构建稳定株可以帮 助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。 3) ，部分细胞种类 ，病毒载体亦无法达到高转导效率 ，通过构建稳定株 ，达到外源片段的高效表达。 4) ，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能 ，通过构建稳定株 ，可以 大大降低频繁转染或者病毒包装的成本 ， 也极大方便实验研究。 5) ，部分蛋白稳定性极强 ，瞬时 RNA 干扰因为作用周期短 ，只能抑制目的 基因的表达 ，但无法去除已经表达的目 的蛋白 ，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。 6) ，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。需要构建稳定细胞株 ，以防止注射入动物体内后 ，很快外源片 段表达丢失。 7) ，细胞个体差异(同一类细胞 ，不同个