Nanopro1000超微量蛋白分析系统使用说明.PDFVIP

Nanopro1000 超微量蛋白分析系统使用说明 一、细胞裂解 1. 收集细胞后4℃，500g/5 分钟； 2. 然后冷PBS 洗涤细胞两次，4℃，500g/5 分钟； 3. 细胞计数； 4. 完全去除细胞上清； 5. 加入预冷后的细胞裂解液； 细胞裂解液配制：Bicine/CHAPS (Cell Biosciences, p/n 040-764), 1x DMSO Inhibitor Mix (Cell Biosciences, p/n 040-510), 1x Aqueous Inhibitor Mix (Cell Biosciences, p/n 040-482). 6. 裂解液体积： 细胞数 裂解液体积 少于105 10-20 μL 5 6 10 -10 20-50 μL 多于106 50-100 μL 7. 冰上孵育5 分钟，然后轻微上下颠倒混合5 次；然后冰上孵育30 分钟，每5 分钟轻微震荡一次； 8. 离心机14000g 离心15 分钟，4℃； 9. 然后将上清液立即转移到一个干净的微量离心管中，弃沉淀； 10. 如果不能马上进行实验，干冰或液氮快速冷冻，-80℃冰箱保存。 二、实验步骤 1. 将细胞裂解后的蛋白通过BCA 法定量，浓度稀释到0.2 mg/mL 左右； 2. 将1 份的细胞裂解液加入3 份Premix G2 和pI Standards 混合液（Premix G2： pI Standards = 40:1)混合，使得蛋白的最终浓度为0.05 mg/mL； 3. 然后将 2）配好的样品混合物、一抗、二抗、显色液，每孔 6 μL 分别加入 384 空白特定区域； 4. 上机操作。 三、结果分析:使用Compass 软件分析结果。 Nanopro1000 超微量蛋白分析系统使用注意事项 1. 实验前一定仔细查阅目的蛋白的特性和等电点； 2. 一定要选取最适合的抗体。需抗蛋白的原始表位的抗体，最好是 已经做过nanopro1000 实验，已经进行过验证的抗体；可查阅 proteinsimple 抗体库 /antibody/antibodies.html 3. 得到好的实验结果保证蛋白的活性是最重要的，实验时尽量选取 新鲜样品，实验当天完成。因为蛋白裂解过程中未变性，长时间 保存会严重降低蛋白的活性； 4. 实验前，一定寻找最佳实验条件使用最少的细胞进行实验研究； 5. 对于等电点大于 10 的蛋白，推荐：0.5-1.5%TEMED，明显提高等 电点检测范围。 负责人：程雪莲、任怡然、白杨 四、实验所需试剂 1. 蛋白浓度检测: 2. 使用BCA 法定量蛋白浓度； 3. 样品稀释液：Bicine/CHAPS 裂解液加上1x DMSO Inhibitor Mix； 4. Ampholyte premix: i. Premix 5-8 (3-10) (Cell Biosciences Premix G1, p/n 040-643 or Premix G2, p/n 040-972)； ii. pI standards: pI Standard Ladder 3 (Cell Biosciences, p/n 040-646)或pI Standard Ladder 3； 5. 细胞洗液:Wash Buffer (Cell Biosciences, p/n040-654)； 6. 抗体稀释液 :Antibody Diluent (Cell Biosciences, p/n 040-309)； 7. 一抗:抗体稀释液1:50 稀释； 8. 二抗：Anti-Rabbit HRP (Cell Biosciences, p/n040-656), 抗 体稀释液1:100 稀释； 9. 显色液:Luminol/Peroxide: 1:1 混合 (Cell Bioscien