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MTT法检测蛋白对PBMC的增值效果一、猪外周血单个核细胞（PBMC）的分离培养1、原理：常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。2、方法 2.1 在猪颈静脉取外周血15ml,1:1的PBS稀释。 2.2 按5ml稀释液加入5ml人的淋巴分离液（密度1.077），18-20度，400gx30min。 2.3 吸取浅色云雾层细胞，重悬于RPMI-1640中，1000rpm离心10min,重复两次 2.4 重悬于含20%FBS的RPMI-1640中，细胞稀释为5x10*7个/ml,培养于96孔板中。蛋白对PBMC的增值可溶性蛋白 1.1 将大肠杆菌表达的可溶性蛋白pGM-CSF蛋白稀释成13个梯度，分别为210ug/ml、105ug/ml、52ug/ml、26ug/ml、13ug/ml、6ug/ml、3ug/ml、1.5ug/ml、750ng/ml、370ng/ml、185ng/ml、92ng/ml、46ng/ml。实验组每孔加入不同浓度蛋白，空白组加入等量的RPMI-1640培养液，每个处理均设三次重复。 1.2 空载体对照菌和pMG-2-pGM-CSF/L.casei 393菌液诱导100ml,5000rpm离心10min后利用透析袋将将上清进行浓缩使用分光光度计测得总蛋白浓度6.224mg/ml和6.425mg/ml,进行倍比稀释浓度为3mg/ml、1.5mg/ml、750ug/ml、375ug/ml、185ug/ml、92ug/ml、46ug/ml、23ug/ml、12ug/ml、6ug/ml、3ug/ml、1.5ug/ml、750ng/ml。每孔加入100ul的稀释蛋白，每个稀释度重复三次，以同样条件诱导并进行浓缩和倍比稀释的pPG-2/L.casei393上清蛋白作为对照。 1.3 取50ml诱导后不含质粒的pPG-2/L.casei393和转化后含有pGM-CSF质粒的pPG-2-pGM-CSF/L.casei 393菌液，于5000rpm离心10min,收集菌体，加入5ml1xPBS将菌体悬起，进行超声破碎，使用分光光度计测得蛋白总浓度为3.262mg/ml和3.19mg/ml,进行倍比稀释浓度为1.6mg/ml、800ug/ml、400ug/ml、200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12ug/ml、6ug/ml、3ug/ml、1.5ug/ml、750ng/ml、375ng/ml。每孔加入100ul的稀释蛋白，每个稀释度重复三次，以同样条件诱导并进行浓缩和倍比稀释的pPG-2/L.casei393菌体蛋白作对照。包涵体 *包涵体蛋白的纯化与复性原理：在大肠杆菌中表达的含二硫健真核生物的重组蛋白往往以包涵体形式存在，重组蛋白二硫键错配，蛋白无活性。可用变性剂破坏蛋白质高级结构及肽链之间疏水作用（可逆），10:1的氧化型和还原型谷胱甘肽可使溶菌酶、核糖核酸酶、牛胰蛋白酶抑制剂形成正确的二硫键。方法：2.1 离心收集经诱导表达重组菌200ml,重悬于PBS中(含1mg/ml溶菌酶）。 2.2 冰浴30min,超声波破碎菌体，12000r/min,离心10min,收集沉淀。 2.3 将沉淀用包涵体洗涤液匀浆洗涤3次12000r/min 离心10min,收集沉淀。（洗涤液：50mM/L Tris-HCl PH 8.0, 1mM/L EDTA,0.2%TritonX-100,2mol/L尿素） 2.4 用5ml包涵体变性液溶解沉淀，12000r/min,离心10min,收集上清液。（变性液：50mM/L Tris-HCl PH8.0, 2mmol/L2-ME,8mmol/L的尿素。 2.5 将上清液缓慢稀释到复性缓冲液中，调整复性缓冲液中蛋白浓度约为100ug/ml 4度复性24h.(复性缓冲液：50mmol/L Tris-HCl PH8.0 , 0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.5mmol/L尿素）2.6 离心收集上清，过Ni-NTA亲和层析柱，以洗脱缓冲液（含20-100mmol/L咪唑的复性缓冲液）洗脱，分布收集洗脱峰，对蛋白质过程进行S