电磁场在转录水平对胚胎干细胞源性神经前体细胞凋亡相关基因的影响论文.docVIP

　　电磁场在转录水平对胚胎干细胞源性神经前体细胞凋亡相关基因的影响论文 秦雅鑫，宋琦，殷樱，许川山 【摘要】 目的： 利用小鼠胚胎干（ES）细胞分化成神经前体细胞模型，研究极低频率电磁场（ELFEMF）对细胞周期调节基因、凋亡相关基因以及细胞增生和凋亡的影响. 方法： 分离、培养和诱导ES成神经前体细胞，于诱导后第4日起，实验组予ELFEMF干预，对照组采用假暴露.freelRNA 表达升高(P 0.01; P 0.05). GADD45转录水平在终末期（4+23 d）下降(P 0.01). 结论： EMF能够暂时性地影响ES源性神经前体细胞凋亡和细胞周期调控相关基因的转录水平，但这些改变不足以使细胞发生可检测到的细胞生理上改变. 【关键词】 小鼠; 胚胎; 干细胞；低频率电磁场；基因, bcl2；bax；GADD45 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of electromagic fields on the cell cycle regulatory gene and apoptosisrelated gene and on cells proliferation and apoptosis odel of mouse embryonic stem cells (ESCs) differentiated into neural progenitor cells. METHODS: ESCs ental group ely loagic fields, exposure. Immunofluorescence of BrdU and Nestin ent and differentiation, and RTPCR ental and control groups in cell groic embryo; stem cells; loagic fields; genes bcl2; bax; GADD45 0引言 多能胚胎干（ES）细胞可以分化成三个胚层的特异性细胞. 在分化的过程中，ES细胞再现了早期胚胎的发育过程，因此这提供了一个极好的体外分析遗传和环境因素对细胞分化影响的模型［1］. 极低频率电磁场（ELFEMF）指频率为0～300 Hz的交变电磁场，电磁场对生物体作用的研究已比较广泛，虽然大多数研究结果存在较大差别，但是磁场对肿瘤（肿瘤被认为属于干细胞疾病）的影响已经有比较一致的结论［2］. 神经干细胞在没有形成大量的化学突触前，由于大量电突触的存在，细胞间直接的电流活动，很可能通过外加磁场而影响细胞的信号通讯，甚至可能改变细胞的发育、迁移等. 本实验我们研究ELFEMF对细胞周期调节基因、凋亡相关基因以及细胞增生和凋亡的影响. 1材料和方法 1.1材料 取孕3 d母鼠囊胚. 在实体显微镜下先将变性或不正常的胚胎剔除掉，然后再将正常的囊胚和桑椹胚转移到饲养层上，置培养箱培养4 d，形成拟胚体（embryoid bodies,.freel）和纤连蛋白的无血清DMEM/F12培养液中，将细胞密度调整为（0.5～1.5）×104/cm3的小鼠ES细胞培养置于1 g/L明胶包被的组织培养皿上，使用含有 N2和B27的神经细胞专用培养基 Neurobasal（Gibco公司）在37℃，50 mL/L CO2的孵箱中培养细胞. 培养至第4日，60%以上的细胞分化为神经前体细胞，进行射频电磁场辐照. ELFEMF分为实验组和对照组，于第4+4 d，4+7 d，4+11 d，4+17 d，4+23 d（4为从开始培养计时）分别使用免疫荧光细胞计数和RTPCR检测. 1.2方法 ELFEMF辐射频率选用50 Hz 电力线，2.0 mT，采用5 min开/30 min 关的间断模式于4+4 d时分别辐射48 h；将培养分化至4 d的神经前体细胞随机分为2组，放入射频辐射系统的波导腔内，实验组进行上述辐射，对照组不输入射频信号，进行假辐射. 整个辐射过程中，细胞处于37℃，50 mL/L CO2的孵箱中，温度变化不超过±0.1℃. 1.2.1免疫荧光染色和细胞计数细胞分化后4 d进行免疫荧光染色，选取部分上述的细胞克隆种植于24孔培养板，每组各6孔. Nestin免疫荧光染色检测Nestin免疫反应阳性神经组细胞. BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入上述的细胞克隆（BrdU终浓度为 5 μmol/L）中，培养24 h. 每孔加入40 g/L多聚醛(4℃) 固定20 min，30 mL/L H2O甲醇孵育15 min，去除内源性过氧化物酶. 加正常山羊血清封闭30 min，用抗BrdU mAb (Sigma) 分别进行免疫荧光染色，染色