激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件论文.docVIP

　　激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件论文 季颖 王清清 付洁 高新 宋海峰 【摘要】 寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤。本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CELIF)，通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察，研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素，并对其进行优化。结果表明，随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同，其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外，初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同。因此， 在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化。本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为：初始模板的量为105个分子.freelers)是从大量的组合化学库中筛选出的短链寡核苷酸，它具有靶分子范围广、稳定性好、亲和力高等特点，从亲和分析到疾病诊断与治疗方面，为自然科学和生命科学领域带来了革命性进展1,2。目前用于治疗老年性黄斑退行性病变第一个适配子药物Macugen已于2004年获得了美国FDA批准3。 筛选适配子的经典方法是指数富集配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，主要有3个关键步骤：随机寡核苷酸文库的设计合成、结合适配子与未结合适配子的分离和结合适配子的PCR扩增。文库PCR过程中非特异性产物的出现是一个普遍的现象，而聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)扩增条件的特异性决定了SELEX技术筛选与靶蛋白特异性结合的适配子假阳性的高低，因此结合适配子的PCR扩增是SELEX技术筛选的关键。目前，分析PCR扩增产物的主要方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳4和琼脂糖凝胶电泳5，通过电泳条带的数目和深浅判断PCR条件的优劣，对扩增片段大小的判断并不十分准确。利用毛细管电泳技术定性和定量分析核酸类物质是近几年的分析工作者研究热点，毛细管电泳(Capillary electrophoresis, CE)分析具有准确、精确、灵敏和重现性好的特点，现已广泛应用于PCR产物的定量分析6～9。 本研究采用毛细管电泳技术优化随机寡核苷酸文库PCR条件，如PCR循环次数、初始模板分子数、DNA聚合酶浓度以及退火温度等，并将其与均一模板的扩增条件的异同进行比较。实验发现，寡核苷酸文库与均一模板的PCR扩增方式明显不同。在考察初始模板分子数对文库PCR扩增的影响时发现，初始模板分子数对文库的PCR扩增影响显著，提示文库的随机性不同扩增条件也有所差别，所以在进行SELEX筛选之前一定要对文库的PCR扩增进行优化。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，配有激光诱导荧光检测器(LIF);Beckman MDQ 毛细管电泳仪，配488 nm氩离子激光诱导荧光检测器，激发波长/发射波长为488/520 nm;未涂层熔融石英毛细管(50 cm(有效分离长度)/60.2 cm(总长度)×75 μm内径，河北永年光纤厂); MJ Opticonchromo 4荧光定量PCR仪(美国BioRad公司)。 TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP(TaKaRa公司)。DNA随机寡核苷酸文库及引物由上海生工合成，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。所有缓冲液均使用去离子水配制，并用0.22 μm滤膜过滤。 2.2 实验方法 2.2.1 PCR扩增 设计合成随机DNA文库10 5′CTTCTGCCCGCCTCCTTCC(N39)GGAGACGAGATAGGCGGACACT3′，80 nt的均一模板：5′CTTCTGCCCGCCTCCTTCCGGGAGGACGATGCGGATCAGCCATGTTTACGTCACTCCTGGAGACGAGATAGGCGGACACT3′PCR。5′端引物：5′FAMCTTCTGCCCGCC TCC TCC3′，其中荧光素标记以便毛细管电泳检测;3′端引物：5′AGTGTCCGCCTATCTC GTCTCC3′。PCR混合液(1.25 mmol/L MgCl2，10 mmol/L TrisHCl，50 nmol/L KCl，250 μmol/L dNTP，5 U/μL Taq DNA聚合酶，一定浓度的模板和引物)。PCR最终条件模板的量为6×105个分子，引物的量为6 pmol，DNA聚合酶的浓度为0.05 U/μL。PCR扩增条件：94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性10 s;70 ℃退火10 s;72 ℃延伸10 s;最终72