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封面故事 - 突破重圍 -ELISA 技倆大破解 PART II 突破突破 重圍 技倆大破解 撰文:林建源 ELISA 技倆大破解（二） ELISA 自我檢視，突破盲點 ELISA為一種利用抗原與抗體間高度專一結合的特性所發展出的分子生物技術，因其具有高敏感度及 高特異性，所以被廣泛的應用，不過我們常見到因為樣本因素、試劑因素、操作因素、甚至判讀儀 器的因素而產生錯誤的結果，以下為一些操作 ELISA 實驗常出現的問題，在這裏做一一分析。 1 一般 ELISA 試劑均保存於 4℃ 或 -20℃，因此在操作 ELISA 實驗前，必須將這些試劑組置於 室溫下約 20-30 分鐘進行回溫並且確認回溫後無結晶的產生，若試劑回溫後有結晶的產生 ，尤其是濃縮包裝的清洗液，將該試劑做適當的混勻來溶解所有的結晶。以濃縮包裝的清洗液來說 ，若没有將這些結晶溶解掉，則以此配製好的清洗液，其濃度將會較原始廠商所設定的還低而無法 達到預期的清洗效果，因此將導致背景值增高。 2 在 ELISA 實驗中，清洗步驟是相當重要的關鍵，它可以將反應過程中殘留於微孔盤內非專 一性結合於抗原或抗體的物質及干擾反應的物質清除掉，因此若任意減少清洗的次數，清 洗時間及清洗的體積將造成清洗不夠確實而大大提高背 景值。常有人使用單爪微量分注器或多爪微量分注器， 但手動方式常洗不乾淨而導致背景過高；建議使用自動 清洗儀（如 CAPPwash 為一方便的半自動清洗器，最適 合ELISA 量不大的實驗室）來進行微孔盤的清洗，同時必 須確認每一個孔洞所加注的清洗液體積是否相同，主要 是自動清洗儀很容易因為保養的疏忽而造成某些清洗頭 不同程度的阻塞，於是加注於每個孔洞的清洗液體積都 會不相同，另外加注清洗液的體積，以 96 孔微孔盤來說 ，不要超過 300ul，雖然實際加注 300ul 的體積量並不會 溢出來，但是因為自動清洗儀在清洗過程中會有移盤的 動作，其移盤的加速度可能會使孔洞上緣的液體甩出來 圖1、CAPPwash 8 提供一般實驗室經濟且方便的選項 而污染其他的孔洞。 3 使用 96 孔微孔盤進行 ELISA 測定時，過程中若需要將微孔盤加熱至 37℃ 或更高時，常發 生所謂的邊際效應，意即微孔盤外圍孔洞與中心範圍孔洞產生了熱力學梯度而造成外圍孔洞 與中心範圍孔洞的溫度差異，進而影響反應速率，因此最後導致兩者間的顯色不同，而不同的加熱 方式也會產生不同的熱力學梯度，一般來說，加熱方式若是使用加熱板接觸微孔盤底部，或像是 ELISA 判讀儀內部上下兩片加熱板夾住微孔盤進行加熱，因為外圍孔洞較接近周圍的冷空氣而使得溫 20 岑祥股份有限公司 .tw 台北02-2785-1156 新竹03-530-7592 台中04-2471-0255 高雄07-343-1735 封面故事 - 突破重圍 -ELISA 技倆大破解 PART II 度偏低，當然也造成最後的顯色偏低，若是加熱方式是 採用空氣循環來加熱的方式，因為外圍孔洞與周圍的熱 空氣有較大的接觸面積，所以能夠更快速的達到所設定 的溫度，相較於中心範圍孔洞會有較高而正確的溫度， 因此在操作控溫於室溫以上且對於溫度較敏感的實驗時 ，建議將操作的標準品及樣本置於中心範圍的孔洞，避 免加注在外圍孔洞即可大大降低邊際效應的影響。或是 您亦可選擇來自德國工藝的 BMG Spectrostar Nano， 不僅可做可見光全光譜掃描，且加大加熱板設計及獨特 「盤子8字法閒晃」模式，都可以有效降低溫差邊際效應 。BMG 原廠更直接測得微孔間實際液體溫差僅 0.3℃； 實為溫控實驗的最佳良伴。 4 微孔盤須妥善保存，避免刮傷污損或手指直接碰觸，尤其是微孔盤底部，因為這是儀器偵