第八章 酶的定向进化.pptVIP

第八章 酶的定向进化 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已广泛应用于各个领域：医药方面、食品工业方面、轻工、化工方面、能源开发方面、环境保护方面等等 天然酶的局限： 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求 而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低 还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非天然底物具有惰性 在非水环境下的低活力 对辅酶的依赖等 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景 试管中的进化是生物工程的未来 内容简介 酶定向进化简介：基本原理、研究历史 定向进化的策略：无性进化、有性进化、同源重组 基因文库的构建与筛选：考虑要素、构建策略、构建载体系统、文库筛选 定向进化应用 定向进化优势、现状和未来 1.研究历史 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是　Sol Spiegelman 在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行的一个实验，当时他的目的是为了证明达尔文的自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并没有实际的应用价值 　　1981年，B.G.Hall等报道了他们定向改变大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。 　　1986年R。Hageman等进行了开发有效提高常温生物中酶分子热稳定性的实验。 将对卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸转移酶基因转化进大肠杆菌，获得基因的突变库 将突变库转入可以在高温下生长的耐热菌，即嗜热脂肪芽孢杆菌中 通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃下稳定的突变酶(Asp80Try)和一个在70℃稳定的突变酶(Asp80Try，Thr130Lys) 2.基本原理 利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程 化学进化 生物进化 生物的自然进化 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因(同源基因，或同工酶) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（木糖——木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物 什么是定向进化技术 概念提出： 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。 酶分子改造： 化学修饰，定点突变 定向进化 模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。 定向进化与自然进化的异同点 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同： 酶分子定向进化 模拟自然进化过程(随机突变+自然选择)，在体外对酶基因进行人工随机突变，建立突变基因库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有预先期望的具有某些特性的酶的突变体的技术过程。 随机突变+定向选择＝目标突变体 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 对酶分子的研究可以分为认识和改造两个方面，前者是利用各种生物化学，晶体学光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究，获得酶分子特征，空间结构和功能之间的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分子的合理设计。如化学修饰，定点突变等。 3. 定向进化的基本过程 随机突变 构建突变基因文库 定向筛选 3.1 随机突变 易错PCR技术 DNA 重排技术(DNA　Shuffling) 基因家族重排技术 易错PCR技术 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ 提高Mg2+浓度 优点：简便，随机突变丰富 缺点：正突变率低，突变基因文库大，筛选工作量大。 适用于较小基因的定向进化 DNA 重组技术(DNA Shuffling) DNA改组具有以下有用的特征： ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的有利突变； ②重组可伴随点突变同时发生； ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变会被有害突变的负背景