ELISA、westernblot、免疫组化、RTPCR实验方法原理及其在SCI论文材料方法、结果中的写作—培训课件.pptVIP

生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 * 生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 结果分析 免疫组化 阳性着色细胞计数法：在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。 Melatonin：褪黑素 Hy: hypoxia缺氧 Nestlin: 巢蛋白，特异性的表达在神经上皮干细胞 神经干细胞增殖分化 Journal of Pineal Research IF = 7.812 结果分析 免疫组化 灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用Image pro plus进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。 结果分析 免疫组化 评分法：通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。 相同曝光时间、相同显色时间 大体分为阴性、弱阳性、阳性 B D C A E F G H Ⅱ Ⅲ Ⅳ Normal 常见问题分析 免疫组化 原因? 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 染色过强 常见问题分析 免疫组化 染色弱 原因 解决办法 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟 试剂超过有效使用期 及时更换试剂 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟 常见问题分析 免疫组化 染色阴性 原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原? 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误 常见问题分析 免疫组化 非特异性背景染色 原因 解决办法 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素? 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 写作实例 免疫组化 IF = 1.959 写作实例 免疫组化 IF = 5.006 写作实例 免疫组化 ?IF = 3.534 写作实例 免疫组化 ?IF = 3.534 Real Time PCR 几个概念 Real Time PCR定义 应用 原理 结果分析 写作实例 Real Time PCR 几个概念 PCR，RT-PCR，Real Time PCR，qPCR PCR：Polymerase Chain Reaction。 RT-PCR：Reverse Transcription PCR，首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。可对基因表达进行相对定量；也有称Real time PCR为RT-PCR。 Real Time PCR：实时聚合酶链反应。 qPCR：Real time Quantitative PCR Detecting System（Real Time PCR），实时荧光定量PCR。 Real Time PCR 定义 荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR