纤维素酶水解壳聚糖的工艺研究.pptVIP

纤维素酶水解壳聚糖的工艺研究 孙英婷 指导老师：李全阳 摘要： 利用绿色木霉产生的纤维素酶水解壳聚糖制备低聚壳聚糖，并对其水解进行了研究。该试验通过单因素实验研究了纤维素酶对壳聚糖的酶学性质、底物浓度对酶水解壳聚糖的影响、酶加入量对水解壳聚糖的影响、反应时间对壳聚糖聚合度的影响及水解产物TLC分析。 关键词：纤维素酶、壳聚糖、降解 一、引言 二、实验材料 三、实验方法 四、分析方法 五、实验结果与讨论 一、引言： 壳聚糖(chitosan)是甲壳素(3-1，4聚一2一乙酰氨基一D一葡萄糖)部分脱乙酰基后的产物，是一种为数不多的天然碱性多糖，其资源量仅次于纤维素，结构见图1。 壳聚糖具有许多生理活性和功能性质，包括提升免疫力、改善消化机能、降低胆固醇、调节人体酸碱平衡、修复神经吸附和排除体内有害重金属、减肥等多种保健功能；以及澄清剂、稳定剂、抑菌剂等。但由于分子量大、水溶性差，不易被利用而使其应用受到限制。低聚壳聚糖具有较高的水溶性，在保持了壳聚糖生理活性和功能性的同时，还具有其独特的生理活性和物化性(如降低血脂、降低胆固醇，良好的保湿功能，从中提取抗肿瘤制剂，工业絮凝剂、金属螯合剂、造纸和印染的原料、农业液体复合肥料添加剂以及种子包衣等。 壳聚糖的降解方法 ⒈ 酸降解法 ① 盐酸降解法；② 硫酸降解法 酸对壳聚糖的降解过于剧烈，且产品分子量分布较宽、降解时间长或存在其它副反应等受到限制 ⒉ 氧化降解法 ① UV／H2O2；② NaCIO／H2O2 H2O2降解法存在的另一个大的问题是降解过程的后期常常伴有褐变反应分析认为壳降解过程中发生了羰氨反应。 ⒊ 酶降解法 ①专一性酶降解（壳聚糖酶、几丁质酶等 ） ②非专一性酶降解 （纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶等 ） 无副反应、降解条件温和、降解过程及降解产物相对分子量分布容易控制、制备的低聚壳聚糖生物活性高，产物不用除盐等优势 ⒋ 复合降解法 二、实验材料 1. 实验材料 纤维素酶液(由绿色木霉发酵制得，以壳聚糖为底物测得酶活为0．37U／mL) 纤维素酶粗酶粉(由绿色木霉发酵制得，以壳聚糖为底物测得酶活为17．87U／g) 脱乙酰度为96％的壳聚糖(浙江金壳生物化学有限公司) G型硅胶板(青岛裕民源硅胶试剂厂)。 2.实验仪器 恒温水浴锅、铁架台、移液管，5μL的枪、分析天平（精确度0.0001g）、烧杯等。 三、实验方法 3.1 粗纤维素酶对壳聚糖的酶学性质研究 3.1.1 pH值对纤维素酶水解壳聚糖活性及pH值稳定性的影响 分别配制不同pH值的0.5％壳聚糖溶液及一定稀释度的不同pH值的粗酶液，各移取0.2mL粗酶液加入1mL对应pH值的底物中，50℃保温30min,测壳聚糖酶酶活，以酶活力最高的为相对酶活100％计，计算各pH值条件下的相对酶活。 3.1.2酶的pH值稳定性 配制浓度为0.5％、pH值为5.0的壳聚糖溶液，将纤维素酶液分别与0.2mol/L不同pH值的醋酸一醋酸钠(pH值3.6～5.8)、磷酸盐(pH6.0—8.0)的缓冲溶液混合，并在50℃保温30min。然后按上述方法测定残余酶活力，以同样稀释度的原酶液的酶活力为相对酶活100％计，计算各pH值条件下的相对酶活。 3.1.3 温度对纤维素酶水解壳聚糖活性及热稳定性的影响 将酶液用最适pH值的醋酸醋酸一钠缓冲液进行适当稀释，各移取适当稀释酶液0．2mL加入1mL0．5％、pH值为5．0的壳聚糖溶液中，摇匀，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃反应30min，测其壳聚糖酶酶活，以酶活力最高的为相对酶活100％计，计算各温度条件下的相对酶活 3.1.4 酶的热稳定性 将上述酶液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃保温，每30min、60min、90min、120min取出一定量的酶液，按上述方法测定残余酶活力，以初始酶活为相对酶活100％，计算各温度条件下不同反应时间的相对酶活。 3.2底物浓度对纤维素酶水解壳聚糖的影响 配制不同浓度的脱乙酰度为96%的壳聚糖溶液各100mL，调pH值为5.0。在一定温度，按照3.5U／g底物的酶量,分别向1%、3%、5%、7%、9%的壳聚糖溶液中加入一定量的纤维素酶，50℃搅拌，每隔2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h取样，测水解液中还原糖含量。 3.3 酶量对纤维素酶水解壳聚糖的影响 将自制的粗酶粉按照2U／g、4U／g、6U／g、8U／g、10U／g底物的量，加入到3％的壳聚糖溶液，在一定温度、pH值条件下反应24h，测壳聚糖水解率。 3.4 反应时间对水解产物平均聚合度的影响 向3％壳聚糖溶液中加入纤维素酶(6U／g底物)。在50％、pH5.0条