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SDS测量蛋白质分子量 实验目的 学习聚丙烯酰胺凝胶聚合原理； 学习不连续聚丙烯酰胺凝胶分离原理； 掌握垂直板电泳的操作方法； 学习SDS测蛋白分子量原理并测定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳— PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis) 支持介质－聚丙烯酰胺凝胶 聚合原理： 影响聚合因素 大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。 某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 温度高聚合快，温度低聚合慢。 碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与AP浓度的平方根成正比。 聚丙烯酰胺凝胶优点 化学性质稳定；凝胶孔径可调； 重复性好；分辨率高； 灵敏度高，可以测定10-6浓度的样品。 凝胶浓度的计算 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是： 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。 分子量范围与凝胶浓度的关系 不连续凝胶电泳（disc）的分离原理 (一).原理 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。 不连续凝胶电泳洗脱 碱性不连续－分离酸性样品 酸性不连续－分离碱性样品 大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。 ①浓缩效应 ②分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的PH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出 gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和PH 值中泳动，依其分子量的大小而分开。 操作 垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系统的组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶配制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测 缓冲液系统 浓缩凝胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。 标准蛋白质样品 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）已知的合适的分子量范围的、构形相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。 样品的浓度 分析目的、检测方法和样品的组成是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml 加样 电泳 光吸收 检测 考玛斯亮篮染色 染色 银 染 色 SDS测蛋白质分子量 SDS是在PAG系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断 裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能 使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合 物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状 态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了 各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按 重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分 子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量 的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X 为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对 分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进 行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制 备过程中