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PH区带逆流色谱技术 (pH—zone—refiningCountereurrenct Chromatography) 徐秀芳 主要内容 PH区带逆流色谱发展 PH区带逆流色谱原理 影响分离效果的因素 PH区带逆流色谱应用 发展与现状 。 pH区带逆流色谱（pH-zone-refining counterrent chromatography）由Ito于1994年首次提出，利用待分离有机酸碱的酸!碱解离常数及疏水性的不同进行分离。与普通逆流色谱相比其突出特点是在溶剂体系的固定相中加入保留酸（或碱）同时在流动相中加入洗脱碱（或酸）不同物质洗脱出来时伴随着ph 值的突变。该技术可以得到最小重叠的矩形峰同时杂质被集中在峰的两侧具有样品分离容量大。分离纯度和分离效率高等优点。 PH区带逆流色谱的原理 以分离碱性物质为例 (见图1) 与ph 突变相对应保留碱在柱子前沿形成一个边界 在边界左侧 碱性待分离物质从洗脱酸获得质子并进入流动相( 位置4) 溶质正离子穿过边界时置于高ph 值范围内 (位置 1)于是被保留碱夺去质子后回到疏水性的非离子形式并很快进入固定相中( 位置2)。当保留碱边界向前推移时 失去了质子的溶质分子又被重新置于低ph 值范围内( 位置3) 获得质子而回到流动相中 (位置4) 这一过程不断重复 直至保留碱流出色谱柱。 逆流色谱转速 固定相保留值和转速的关系（见图3） 溶剂组成 进样量 由图6可知，只要在逆流色谱的处理范围内，进样量越大，重叠率越小，分离效果越好，这是因为在ph区带逆流色谱中，流出物的浓度主要有洗脱酸（碱）的浓度决定。 酸碱浓度 由图7可知，在其他条件不变的情况下，对于生物碱来说，洗脱酸浓度越小分离效果越好，在洗脱酸浓度为6m mol/L的时，RS=1.5,实现了完全分离。 应用 谢谢大家！ 再见! * * 逆流色谱(Countercurt Chromatography,简称CCC)是一种无需任何固体支撑体的液液分配色谱分离技术，被分离物质根据其在互不混溶的两相溶剂中的分配系数的不同而达到分离。由于不使用固体支撑介质．因而避免了样品的不可逆吸附引起和失真等，全回收成为可能。逆流色谱分离技术已经被证明是一种非常有效的制各和半制各手段，近年来已被广泛应用于天然成分的分离纯化。由于不使用固体支撑介质，逆流色谱有着许多液相色谱所没有的优点：CCC柱可以通过改变不同的溶剂体系来分离不同极性的化合物；不必担心粗样会污染损坏CCC柱；同一根CCC柱可以用于分析量级也可用于制各量级的分离。因此放大起来比较简单。 高速逆流色谱（HSCCC) 双向逆流色谱（DuCCC） 正交轴逆流色谱 Ph区带逆流色谱 保留碱 或酸 的作用是在溶质区前面将溶质从流动相转移到固定相中 洗脱酸 或碱 的作用是在溶质区后面将溶质从固定相转移到流动相中 当存在多种较大量的溶质时 具有最大= pka 值和亲水性的溶质首先流出柱子 依此类推 并以不同溶质区ph 值 的 降 低( 或 升 高 )为 标 志 达 到 分 离 目 的(见图2) 影响分离效果的因素 流动相流速 编号 1 至 3 依次表示转速为 400r/min、600r/min、800r/min, 4表示转速前 600r/min，然后调速至 800r/min的情况。 由图 3 可知，转速越大，保留值越高，分离效果 越好。但是情况 3和情况4 的保留值比较接近，所 以在通常的实验中普遍采用的都是情况 4， 这样既 能保证固定相保留值，也能使仪器不必要长时间在 800r/min 以上高速运转，同时也避免了由于高速旋 转造成的乳化。 根据色谱分辨率的计算公式：计算上述a、b、c图的分辨率依次为 0.9814， 1.4150 和 2.0120 溶剂系统中水的体积含量始终占 50%， 正丁醇的含量代表了系统的极性， 含量高， 极性大， 含量低， 极性小,分辨率与正丁醇含量 （极性） 的关系如图 所示 pH区带逆流色谱(pH—zone—refining CCC)的洗脱色谱图形与顶色谱和等速电泳相似，主要组分的峰组成一系列矩形色谱峰，各色峰之间很少重叠，一般针对可离子化的分子如羧酸、胺等。操作时选择两相体系如甲基叔丁基醚：水，平衡后取上层溶剂加入适量的作为“保留剂”的酸如三氟乙酸并作为固定相，下层溶剂加入适量的作为“取代剂”的碱如氨水并作为流动相。以分离有机酸R1COOH、R2COOH、R3COOH(pKa1pKa2pKa3)为例(图3)，首先将酸化的固定相注人色谱柱中，然后加入用固定相溶解的样品。泵人流动相后，在色谱柱足够长的情况下整个体系达到“等速”状态，与氨水界面移动的速度同步。酸性较强的R1C00H先与氨水作用，转化为 R1COO一和NH4+产生，但R1CO