Hucker 改良的革兰氏染色法.docVIP

Hucker 改良的革兰氏染色法 一、实验目的 1、了解革兰氏染色法的原理及操作方法 2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性 3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术 4、掌握显微镜（油镜）的使用方法 5、初步认识细菌的形态特征 二、实验原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液媒染，用酒精脱色，革兰氏阳性菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。革兰氏阴性菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。 三、实验器材 1、设备：显微镜（尼康YS100、YS2-H； ） 2、材料：酒精灯、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、载玻片、盖片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液（结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液）、生理盐水 3、菌种：（1）大肠杆菌；（2）枯草芽孢杆菌 四、实验步骤 1、涂片 取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐水，且均匀分布，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯草芽孢杆菌斜面上各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。 2、干燥 室温自然干燥。 3、固定 涂面朝上，通过火焰2-3次。 4、初染 滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色1-2min，水洗。 5、煤染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 6、脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇通过涂面脱色20-25s，直至流出液无色时，立即水洗。 7、复染 用番红液复染约2min，水洗，晾干或用吸水纸吸干。 8、镜检 镜检时先后用低倍镜、高倍镜和油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。 9、实验完毕后的处理 先用擦镜纸将油镜头上的油擦去，用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次，再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。 五、注意事项 1、载玻片要洁净无油迹；要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 2、固定操作中，火焰不宜过热，以玻片不烫手为宜。 3、革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌；脱色时间一般为20-30s。 六、思考题 1、你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些细节？ 2、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3、如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？ 4、你认为要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪一步？为什么？ 5、现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确？ 6、你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 7、进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老菌龄细菌染色时会出现什么问题？ 8、革兰氏染色时初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？ 9、你认为Hucker 改良的革兰氏染色法中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？ 胰蛋白酶比活性的测定 一、实验目的 1、学习考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理及操作方法 2、了解考马斯亮蓝法在蛋白质含量测定中的重要性 3、学习并掌握分光光度计的基本技术和操作方法 4、掌握酶活性单位及比活性的计算方法 二、实验原理 考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax）由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm下测定的吸光度值A595nm，与蛋白质浓度成正比，据此可以测定出样品中的蛋白质含量。 胰蛋白酶能专一地催化碱性氨基酸中-COOH参与形成的肽键水解，同时也能水解碱性氨基酸所参与构成的酯键。本法采用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzoyl-L-arginine-ethyl ester，BAEE）为底物，该化合物在253nm波长处紫外吸收强度很低，但在胰蛋白酶作用下，水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸（N-benzoyl-L-arginine，BA），该产物A253nm很大。反应