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荧光定量PCR原理及常见问题分析 学习汇报 汇报人：郭荣荣 荧光定量PCR原理 PCR动力学曲线：四个阶段 基线期 指数增长期 线性增长期 平台期 基线期 指数增长期 线性增长期 平台期 荧光定量PCR原理中的基本概念 1.基线：扩增曲线的水平部分 基线的背景信号：模块、试剂、耗材。 2.阈值：设定的一个荧光强度值，穿过阈值 与X周平行的直线为阈值线。 设置阈值的标准： a.高于基线 b.位于指数增长期，且位于重复性较高的区域 3.Ct：阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴的数值。（与起始浓度的对数成线性关系） 阈值线 Ct值 常见问题 一、存在抑制物 二、重复性差 三、可疑扩增曲线 常见问题一 存在抑制物 1、扩增曲线斜率不一致，提示存在抑制物 抑制物：黑色素（头发）、多糖类（DNA）、血红蛋白（血液）、尿素； 乙醇、蛋白酶K、胍盐、苯酚。 2、检查样本质量 a.用分光光度计检测样本260/280比值 eg：DNA纯度：OD260/OD280=1.8 RNA纯度：OD260/OD280=2.0 b.对样本进行梯度稀释，绘制出标准曲线。 正常的标准曲线上所有的点都落在一条直线上，如果落在曲线上则提示存在抑制物。 常见问题二 重复性差 重复的目标是所有复孔CT相似。 原因：a.基线、阈值的设置； b.加样误差（操作规范、加样器）； c.试剂与样品没有充分混匀 （可以先进行离心）； d.没有ROX校准。 常见问题三 可疑扩增曲线 在扩增曲线图中，出现平台期较低的现象。 原因：目标样本的浓度偏低，从而导致较高的Ct值。
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