植物生物反应器—培训课件.pptVIP

* 6.4.3 两种系统的比较 植物稳定整合表达体系 重组植物病毒瞬时表达系统 可通过有性或无性繁殖获得大量转基因后代，可大规模生产 通过接种获得高产量蛋白表达,但不能遗传,不便大规模生产 生产周期长，一般为1年；纯合转基因系要3~4年以上 生产周期短，一般约1~4个月 可表达大片段外源基因 只能表达小肽和表面决定基 表达量低，小于1%TSP 表达量高，可达1%~5%TSP * 第5节 存在问题和可能的解决方法 5.1 外源蛋白表达的水平低 这个问题普遍存在于转基因植物的研究中，对于植物疫苗来说，表达量必须达到较高水平，才能达到口服免疫的效果，而对于在植物中表达需要纯化的抗体以及药用蛋白时，只有当其超过总可溶性蛋白的1%，才具有商业开发价值。 * 为了进一步提高外源蛋白在植物细胞中的表达水平，人们设计了很多策略: (1)蛋白质的靶向定位。在高等植物叶绿体表达外源基因是一种可供选择的转基因体系。叶绿体环形基因在每个植物细胞中可达500~1000个，可显著提高外源基因的拷贝数，从而使基因表达产物成倍增加，甚至可达总可溶性蛋白的47%。 * (2)使用植物病毒作为表达载体，可大大提高外源基因的表达水平。 (3)使用植物偏爱的密码子，植物中遗传密码子的使用频率与动物、微生物不同。适当地对外源基因的密码子进行替换能显著提高该基因在植物中的表达水平。 (4)使用增强子序列，利用组织特异性的启动子，优化先导序列，能够提高外源基因的表达水平。 * (5)使用核基质附着区MAR序列，可以使外源基因在染色质中形成独立的活跃转录单元，不受周围染色质结构的影响，从而提高外源基因的表达水平。 (6)在拟南芥中生产arcelin，同时表达种子贮藏蛋白2S清蛋白的反义基因，结果使得arcelin的表达量占种子总蛋白地4%，利用这个策略有助于显著提高目标蛋白的表达量。 * 5.2 下游生产成本高 尽管植物生产系统的上游生产成本比其它系统低，但如果产物需要提纯。则费用昂贵，因此在上游设计中应注意尽量简化下游的纯化成本。 将外源蛋白多肽与植物油脂蛋白(oil-body)形成融合蛋白在植物中表达，油脂蛋白的亲脂性使之成为一种高效的多肽纯化系统。 * 利用GVGVP作为融合蛋白(GVGVP是一种人工合成基因编码的蛋白多聚体)，只要一步即可纯化，这一方法已成功运用于胰岛素的纯化。 另外，有发展前景的是利用毛状根系统生产外源多肽，即利用转基因植物将目标蛋白从植物根系分泌到液体培养基中，这一系统已成功地生产Guy.s13单克隆抗体(预防龋齿)，产量可达2.4mg/L。 此外，运用植物悬浮细胞培养系统也可减少下游的纯化成本。 * 5.3 安全性问题 目前，转基因产品的安全性仍存在争议，尤其在口服疫苗方面，这一争议就更加尖锐。 例如在转基因研究中用于筛选阳性克隆使用的选择标记基因多数为抗生素抗性基因，因此人们就会担心人食用这种转基因作物后也会产生抗生素抗性。 * 另外，在植物抗体的研究中，抗体上都连有多聚糖，由于动物源的抗体中多为唾液酸，这在植物中缺乏，而植物中富含木糖，这在动物不存在，因此人们怀疑不同的聚糖结构会对植物抗体的免疫原性和致敏性产生影响。这有待进一步的实验确证。 同时，转基因植物具有潜在的破坏生态环境的可能性，因此，制定和完善转基因植物的安全和管理法规尤为重要。 * 展 望 尽管转植物生物反应器仍存在一些问题尚待解决，但利用植物表达系统已成功地表达了多种具有生理活性的外源多肽，而且有些已经进行了人体和动物的试验，其前景是可观的，随着人类基因组计划研究的不断深入，会发现有更多医疗价值的蛋白质，因此利用转基因植物将会成为最具潜力的生产系统来生产这些药物，为人类健康做出巨大的贡献。 * * 诺沃克病毒性胃肠炎(诺沃克病毒性腹泻)是一组由诺沃克病毒感染引起,以恶心、呕吐、腹痛和腹泻为主要临床表现的肠道传染病。该疾病可通过被病毒污染的食物和饮水造成局部暴发和流行。感染诺沃克病毒主要是因为患者食用了海鲜以及凉拌菜、贝类刺身、寿司等没经过卫生加工的生冷食物。 * B-葡萄苷酸酶(GUS)用于生化研究，临床上常用作诊断酶，用于尿及血中甾体化合物的检定。 gus基因自于大肠杆菌，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶或β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS），能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。该酶与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯（5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid，X-Gluc）底物发生作用，产生蓝色沉淀反应，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织