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抗氧化性测定方法
3. 2. 3 冬枣多酚含量的测定
(1)福林-肖卡试剂(Folin-ciocalteu)的配制
称取100克钨酸钠和25克钼酸钠,将两者溶于700mL水中,倒入2L的圆底烧瓶中,再加入50mL85%的磷酸和100mL浓盐酸,放入几粒玻璃珠,给烧瓶连上回流冷凝器,用文火回流10h(可不连续);回流后用50mL蒸馏水冲洗冷凝管上的附着物,然后取下,加150克硫酸锂和几滴溴水(边加边摇直至溶液变黄),加热煮沸15min,(注:最后的颜色应是黄色,不带丝毫的蓝色绿色,发绿即不得使用)。冷却后转移到1L的容量瓶中,用水定容至刻度,过滤贮存于棕色瓶中备用
(2)多酚标准曲线的绘制
取洁净干燥试管7支,分别标号0-6,分别加入预先配制的0.4mg/mL的没食子酸0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35mL,再分别加入双蒸水,2,1.95,.1.9,1.85,1.8,1.75,1.7,1.65mL。将储存备用的福林肖卡试剂稀释3倍,于7支试管中分别加入1mL,将7支试管振荡摇匀,静置3-4min,再于7支试管中分别加入10%的碳酸钠各1mL,放入25℃恒温水浴中2h。进行全波长扫描,在765 nm处有最大吸收波长,在此波长下测定不同浓度标准溶液的吸光值,绘制多酚浓度与吸光度的标准曲线。
(3)测定
将上述八种原液稀释相应倍数之后,各取0.1mL于试管中,在各加入1.99mL双蒸水,其余操作同标准曲线绘制,于765nm波长处测定吸光值。
2.3.2 多酚含量测定
2.3.2.1 多酚标准曲线的制作[5]
准确称取没食子酸标准品200mg,加少量70%乙醇将样品溶化,用70%乙醇定容至100mL,摇匀,静置。再用移液器吸取20mL,用70%乙醇定容至100mL,摇匀,配成浓度为400μg/mL的没食子酸标准溶液,待用。
准确吸取浓度为的没食子酸标准溶液0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35ml
于试管中。分别加入蒸馏水2.0,1.95,1.9,1.85,1.8,1.75,1.65ml, 再各加入福林试剂1ml,充分振荡后静置3-4min:,分别加入10%碳酸钠1ml于25℃,摇匀置于恒温水浴中反应2h,同时做试剂空白,于765nm下测定吸光度,以含量对吸光度进行直线回归,计算回归方程。
2.3.2.2试样多酚含量的测定
将提取液离心,取上清液,按标准曲线绘制的测定方法,依次加入试剂,以试剂空白作参比,用1cm比色皿在765nm处测定吸光度,计算多酚含量。
2.2.3.1 总还原能力测定(铁氰化钾还原法)[19][20]
还原力法的原理为:K3Fe(CN)6+ 样品→ K4Fe(CN)6+ 样品氧化物
K4Fe(CN)6 + Fe3+ → Fe4[Fe(CN)6]3
在波长7 0 0 n m 条件下测定吸光度A ,A 越大,则样品的还原力越大。
在2.5ml pH=6.6 磷酸缓冲溶液中加分别入芦丁标准溶液(0.6mg/ml):0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml,双蒸水1、0.95、 0.9、0.85、0.8、0.75、0.7ml,再加入1% 铁氰化钾1ml,混合物在50℃恒温条件下,加热20min。急速冷却,加2.5ml 10% 三氯乙酸,3500转/分离心分离10min。取上层清液2、5ml、双蒸水2、5ml ,再加0、5ml 0.1%FeCl3,混合均匀,静置10min 后在波长700nm 下测吸光度A 值,绘制标准曲线。
样品测定:分别取720mg/ml的提取液、维生素C、TBHQ、BHT溶液0.5ml代替芦丁标准溶液,其他操作同标准溶液的绘制,测定吸光度。结果如图12、13所示。
2.2.3.2清除DPPH自由基的能力测定[20]
DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其结构中含有3 个苯环,1 个氮原子上有1 个孤对电子,呈紫色,在517nm 有强吸收。有自由基清除剂存在时,DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅,在最大吸收波长处的吸光度变小,而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的,因此可用于检测自由基的清除情况,从而评价实验样品的抗氧化能力。
取0.04mg/ml的DPPH-乙醇溶液1.5ml,加入适量提取液用95%乙醇补足3ml。静置30min,在517nm处测定吸光度。同时测定维生素C、合成抗氧化剂TBHQ 对DPPH 自由基的清除率,作为对比。
清除率 = [1-(A1- A2)/A0]×100
其中:A1 为加提取液后DPPH 溶液的吸光度;
A2 为提取液的吸光度;
A0为未加提取液时DPPH 溶液的吸光度。
结果如图14所示。
2.2.3.3 清除羟自由基作用的测定[20][21]
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