抗氧化性测定方法.docVIP

3. 2. 3 冬枣多酚含量的测定 （1）福林-肖卡试剂（Folin-ciocalteu）的配制 称取100克钨酸钠和25克钼酸钠，将两者溶于700mL水中，倒入2L的圆底烧瓶中，再加入50mL85%的磷酸和100mL浓盐酸，放入几粒玻璃珠，给烧瓶连上回流冷凝器，用文火回流10h（可不连续）;回流后用50mL蒸馏水冲洗冷凝管上的附着物，然后取下，加150克硫酸锂和几滴溴水（边加边摇直至溶液变黄），加热煮沸15min，（注：最后的颜色应是黄色，不带丝毫的蓝色绿色，发绿即不得使用）。冷却后转移到1L的容量瓶中，用水定容至刻度，过滤贮存于棕色瓶中备用 （2）多酚标准曲线的绘制 取洁净干燥试管7支，分别标号0-6，分别加入预先配制的0.4mg/mL的没食子酸0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.35mL，再分别加入双蒸水，2，1.95，.1.9，1.85，1.8，1.75，1.7，1.65mL。将储存备用的福林肖卡试剂稀释3倍，于7支试管中分别加入1mL，将7支试管振荡摇匀，静置3-4min，再于7支试管中分别加入10%的碳酸钠各1mL，放入25℃恒温水浴中2h。进行全波长扫描，在765 nm处有最大吸收波长，在此波长下测定不同浓度标准溶液的吸光值，绘制多酚浓度与吸光度的标准曲线。 （3）测定 将上述八种原液稀释相应倍数之后，各取0.1mL于试管中，在各加入1.99mL双蒸水，其余操作同标准曲线绘制，于765nm波长处测定吸光值。 2.3.2 多酚含量测定 2.3.2.1 多酚标准曲线的制作[5] 准确称取没食子酸标准品200mg，加少量70%乙醇将样品溶化，用70%乙醇定容至100mL，摇匀，静置。再用移液器吸取20mL，用70%乙醇定容至100mL，摇匀，配成浓度为400μg/mL的没食子酸标准溶液，待用。 准确吸取浓度为的没食子酸标准溶液0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35ml 于试管中。分别加入蒸馏水2.0,1.95,1.9,1.85,1.8,1.75,1.65ml， 再各加入福林试剂1ml,充分振荡后静置3-4min:，分别加入10%碳酸钠1ml于25℃，摇匀置于恒温水浴中反应2h,同时做试剂空白，于765nm下测定吸光度，以含量对吸光度进行直线回归，计算回归方程。 2.3.2.2试样多酚含量的测定 将提取液离心，取上清液，按标准曲线绘制的测定方法，依次加入试剂，以试剂空白作参比，用1cm比色皿在765nm处测定吸光度，计算多酚含量。 2.2.3.1 总还原能力测定(铁氰化钾还原法)[19][20] 还原力法的原理为：K3Fe(CN)6+ 样品→ K4Fe(CN)6+ 样品氧化物 K4Fe(CN)6 + Fe3+ → Fe4[Fe(CN)6]3 在波长7 0 0 n m 条件下测定吸光度A ，A 越大，则样品的还原力越大。 在2.5ml pH=6.6 磷酸缓冲溶液中加分别入芦丁标准溶液（0.6mg/ml）：0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml，双蒸水1、0.95、 0.9、0.85、0.8、0.75、0.7ml，再加入1% 铁氰化钾1ml，混合物在50℃恒温条件下，加热20min。急速冷却，加2.5ml 10% 三氯乙酸，3500转/分离心分离10min。取上层清液2、5ml、双蒸水2、5ml ，再加0、5ml 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10min 后在波长700nm 下测吸光度A 值,绘制标准曲线。 样品测定：分别取720mg/ml的提取液、维生素C、TBHQ、BHT溶液0.5ml代替芦丁标准溶液，其他操作同标准溶液的绘制，测定吸光度。结果如图12、13所示。 2.2.3.2清除DPPH自由基的能力测定[20] DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3 个苯环，1 个氮原子上有1 个孤对电子，呈紫色，在517nm 有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的,因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。 取0.04mg/ml的DPPH-乙醇溶液1.5ml，加入适量提取液用95%乙醇补足3ml。静置30min，在517nm处测定吸光度。同时测定维生素C、合成抗氧化剂TBHQ 对DPPH 自由基的清除率，作为对比。 清除率 = [1-(A1- A2)/A0]×100 其中：A1 为加提取液后DPPH 溶液的吸光度； A2 为提取液的吸光度； A0为未加提取液时DPPH 溶液的吸光度。 结果如图14所示。 2.2.3.3 清除羟自由基作用的测定[20][21] 通过