食品中金黄色葡萄球菌检测方法(依据GB4789).docxVIP

食品中金黄色葡萄球菌的检测方法范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。本标准第一法适用于金黄色葡萄球菌的定性检测；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃±1℃。冰箱：2℃～5℃。恒温水浴箱：37℃～65℃。天平：感量0.1g。均质器。振荡器。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器。无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。无菌培养皿：直径90mm。注射器：0.5mL。pH计或pH比色管或精密pH试纸。全自动微生物生化鉴定系统。（BD Crystal或Phoenix）。比浊仪。（BD Phoenix比浊仪，货号440910）。比浊仪定标盒。（BD Phoenix定标盒，货号440911）。培养基和试剂10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤。7.5 %氯化钠肉汤。血琼脂平板。（BD 货号脑心浸液琼脂241830胰蛋白大豆琼脂236950作为基础加兔血浆）Baird-Parker 琼脂平板。（BD 货号 276840）脑心浸出液肉汤(BHI)。（BD 货号 237400）稀释液：磷酸盐缓冲液。(BD货号211544)营养琼脂小斜面。（BD 货号212000）革兰氏染色液。（BD 货号212539）无菌生理盐水。第一法 金黄色葡萄球菌的定性检验检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1：36℃±1℃18h～24h36℃±1℃血平板18h～24hBaird-Parker平板18h～24h或45h～48h36℃±1℃18h～24h图1 金黄色葡萄球菌检验程序操作步骤样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。增菌与分离培养将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。鉴定染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。然后挑取可疑菌落适用Crystal肠杆菌/非发酵菌鉴定试剂盒进行生化鉴定。结果与报告结果判定：符合5.2.3、5.3，可判定为金黄色葡萄球菌。结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。第二法金黄色葡萄球菌的Baird-Parker平板计数检验程序金黄色葡萄球菌平板计数程序见图236℃±1℃ 45h～48h图2 Baird-Parker平板法检验程序操作步骤样品的稀释固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按