斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达.pdfVIP

7 英文缩略词对照表 8 致谢 9 吸虫线粒体基因研究进展（综述） 参考文献 斯氏狸殖吸虫线粒体cytb 基因的扩增、测序，和cytb 基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达 摘要 目的：扩增出斯氏狸殖吸虫线粒体cytb 基因片段并测序，研究 斯氏狸殖吸虫 5 个虫期线粒体 cytb 基因的表达情况并分析对吸 虫研究的作用。方法：（1）分别提取斯氏狸殖吸虫囊蚴、30 天 童虫、60 天童虫、成虫、虫卵的mRNA，并反转录为cDNA 保 存于-20℃。（2）用日本血吸虫线粒体cytb 基因设计出斯氏狸殖 吸虫的线粒体cytb 基因的兼并引物，聚合酶链式反应（PCR）法 扩增出斯氏狸殖吸虫 cytb 基因片段→电泳分离→提纯→连接→ 转化→挑菌→摇菌→送出测序。用所得的测序结果设计斯氏狸殖 吸虫线粒体cytb 基因片段的特异引物。（3）用DNAsis 等软件分 析7 种吸虫的线粒体cytb 基因，并用树的方式表达它们的亲缘 关系。（4）以5 个虫期cDNA 为模板，特异引物为实验组引物， 卫氏狸殖吸虫的 18SrDNA 基因引物作为内参引物做实时荧光定 量PCR （realtime PCR）。根据所获得的结果判断斯氏狸殖吸虫 5 个虫期线粒体 cytb 基因的表达情况并分析与不同虫期虫体致 病情况的关系。结果：（1）获得 542bp 的斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb 基因片段，并将该基因片段纳入NCBI 基因库中。根据该基 因片段设计出一对斯氏狸殖吸虫线粒体cytb 基因片段的特异引 物 CytbF: 5 ′GGTTGCTTGATCATAACATTGG 3 ′CytbR: 5 ′ GACACTCTGGGTCGACCTTG5′(2) 通过在Genebank 数据库中Blast 发现，斯 氏狸殖吸虫的此段cytb 序列与日本血吸虫（中国流行区虫种）、异盘并殖吸虫、 哈氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫以及斜睾吸虫等有相似性，一共有哪些信誉好的足球投注网站到种7 具有同 源性的虫种，对7 种吸虫线粒体cytb 序列利用MEGA4 计算遗传距 离，采用最大简约法（MP）和邻位相连法（NJ）构建系统进化树， Bootstrap 法检验，并Clusterx 软件对7 种吸虫线粒体cytb 序 列进行多序列对比，用DNAsis 软件对实验所得日本血吸虫和斯 氏狸殖吸虫cytb 片段序列进行序列分析，结果显示，用 NJ 和 MP 方法构建的遗传系统进化树拓扑结构相似，同时用 MEGA4 软 件对遗传距离进行分析计算上，所得遗传距离远近分布与所得遗 传系统进化树结果一致。Realtime PCR 结果显示除了虫卵期不 见线粒体 cytb 基因的表达，其他虫期均有表达。结论：1.线粒 体cytb 基因可作为吸虫遗传进化分类的依据。2.线粒体cytb 基 因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达情况与不同时期该虫对宿主 的侵袭危害是成正相关的，也为以后的预防，诊断，治疗提供理 论依据。 关键词：斯氏狸殖吸虫；线粒体；cytb 基因片段；T/A 克隆； PCR ；RT-PCR ；DNAsis;Realtime PCR sequence mitochondria gene cytb of Pagumogonimus skrjabini and cytb expression in different stage Abstract ：Objective： 前言 肺吸虫病是由并殖吸虫(Paragonimus) 引起的一种人畜共患 的地方性寄生虫病，已报道并殖吸虫虫种近 50 种，包括同物异 名、亚种及变种，其中 32 种是在我国报道，并证实可寄生人体 的并殖吸虫就有9 种。在东南亚、非洲与拉丁美洲均有流行，在 我国就有 25 个省、市、自治区流行该病。斯氏并殖吸虫 （Paragonimus skrjabini ）是我国独有虫种，主要分布于四川、云 南、贵州、福建等 14 个省、市、自治区。斯氏并殖吸虫的终末 宿主为犬、猫、果子狸等，能在它们体内发育成成虫，成虫产卵， 卵通过呼吸道排出，在水内孵化成毛蚴，毛蚴钻入第一中间宿主 淡水螺内发育成为尾蚴