文蛤MmPlg基因和MmCtl基因的克隆、表达及功能分析.pdfVIP

摘 要 摘 要 文蛤是我国重要的水产养殖品种，但近年来养殖业 出现了许多严重制约产业发展的 “瓶颈 ”问题，造成了 巨大的经济损失。纤溶酶和组织蛋白酶 L 等在动物的生长发育中 具有重要作用。研究和了解文蛤的生长发育过程和调控机理，对文蛤人工育苗和养殖产 业的发展具有十分重要理论价值和现实意义 。 本文以文蛤为研究对象，研究内容主要分为以下 5 个部分 ： 第 1 部分：通过 RACE 技术从文蛤体内克隆到文蛤纤溶酶原 MmPlg 基因和文蛤组 织蛋白酶 L MmCtl 基因，井对它们的核酸序列和编码的蛋白序列进行了生物信息学分 析； 结果如下： （1）文蛤MmPlg 基因序列全长 921 bp ，包含 1 个 819 bp 的开放阅读框，编码的蛋 白含 272 个氨基酸残基，其中前 16 个为信号肽序列 。MmPlg 蛋白的理论分于量为 28.7 kD ，等电点为 6.42，包含 由组氨酸（His77） 、大冬氨酸（Asp126）和丝氨酸（Ser220）组成的 典型丝氨酸蛋白酶活性位点，序列比对分析发现 MmPlg 和单环刺螠 （Urechis unicinctus） 和栉孔扇贝 （Chlamys farreri）的纤溶酶相似度较高。 （2 ）文蛤 Mm Ctl 基因序列全长 1304 bp ，包含 1 个 1005 bp 的开放阅读框，推导的 蛋白含 334 个氨基酸残基，其中前 16 个为信号肽序列 。MmCtl 蛋白的理论分于量为 37.5 kD ，理论等电点为 5.27. 利用 Conserved Domain SearCh 工具分析 MmCtl 蛋白序列，结 果表明该酶是 Peptidase C1A 亚家族成员，含有木瓜蛋白酶特异的活性催化位点和底物 结合位点。 第 2 部分：以文蛤 -actin 基因为内参，利用实时荧光定量 PCR 技术分析了 MmPlg 基因和 MmCtl 基因在文蛤发育不同时期 （担轮幼虫、D 型幼虫、壳顶幼虫和稚贝）mRNA 表达量的变化 ；利用实时荧光定量 PCR 技术分析了 MmPlg 基因和 MmCtl 基因在文蛤成 贝不同组织 （肌肉、外套膜、鳃、肠和肝胰腺 ）中的 mRNA 表达量变化 。 结果如下： （1）组织定量结果显示结果显示 MmPlg 在各个组织中都有表达，而肠的表达量则 明显高于其它四个组织，是鳃中表达量的大约 2 倍；发育定量结果显示在担轮幼虫和 D I 摘 要 型幼虫时期，MmPlg 的表达量变化不明显，到壳顶幼虫时期，MmPlg 的表达量大幅度 上调，文蛤发育成稚贝后，MmPlg 表达量稍有下调，但还是远远高于前两个时期 。经分 析推测 MmPlg 可能参与文蛤对营养成分的消化； （2 ）组织定量结果显示结果显示 Mm Ctl 在各个组织中都有表达，肝胰腺的表达量 最高；发育定量结果显示，随着文蛤发育 Mm Ctl 表达量呈明显上调趋势，从担轮幼虫到 D 型幼虫 Mm Ctl 表达量稍有上升，到壳顶幼虫期表达量大约为担轮幼虫期的 20 倍，至 稚贝期表达量达到最高 。经分析推测 Mm Ctl 可能通过细胞凋亡等机制参与了文蛤幼虫的 发育过程。 第 3 部分：构建了文蛤 MmPlg 基因的原核表达载体，在大肠杆菌 DE3 宿主菌体内 实现了诱导表达，井对表达的蛋白进行了纯化，用纯化后的 DsbA-MmPlg 融合蛋白免疫 新西兰大白兔，制备了抗血清。 结果如下：获得的融合蛋白 DsbA-MmPlg 的分于量为 52.7 kD，包涵体表达，用纯 化后的融合蛋白制备抗血清，Western Blot 结果表明本实验制备的抗血清具有较好的特 异性 。 第 4 部分：对文蛤 MmCtl 基因进行了原核表达 ，纯化了融合蛋白，井制备了融合蛋 白DsbA-MmCtl 的抗血清。 结果如下：获得的融合蛋白 DsbA-MmCtl 的分于量为 60.5 kD，包涵体表达，用纯 化的融合蛋白进行抗血清的制备，Western Blot 结果显示该血清具有较好的特异性。 关键