甲型肝炎病毒在人源二倍体细胞的分子进化研究.pdf

甲型肝炎病毒是一类被研究较多的病毒，其疫苗的研制开发也相 对完备，但其相关的细胞适应过程中的分子进化数据也相对匮乏。上 世纪八十年代，国外研究人员Cohen等曾对甲肝病毒野毒及细胞适应 后的减毒病毒的全长基因序列做过较细致的比较研究。该研究中减毒 株相比于野毒株一共有24个核苷酸发生变异，其中位于编码区的16 个变异中有12个导致了氨基酸改变。作者认为真正与甲肝病毒的细 胞适应性及毒力相关的决定位点可能只在少数几个核苷酸。鉴于当时 的序列分析手段并考虑到甲肝病毒基因组的多态性，真正的变异数目 应该更小。该研究可以看作是研究甲肝病毒在已知限定条件下的分子 进化的开端，但后续报道极少。 对甲肝病毒毒力基因进行定位的研究主要见于国外的研究小组， 其成果集中体现于美国Emerson小组的研究结论。该研究的核心手段 是用特定限制性核酸内切酶分别对甲肝病毒强毒和弱毒株基因组进 行切割，然后人工构造嵌合体甲肝病毒，并辅以动物试验对获得的嵌 合体病毒进行毒力分析，以获得有意义的毒力基因信息。该研究最终 定出了一个可能性极大的范围，包括六个核菅酸：属于甲肝病毒基因 组VPl／2A区段的3025、3 4563。该研究结果可信度极高，但存在一定的局限性，即没有考虑到 人工构造的嵌合体病毒的稳定性。该文作者也指出这些嵌合体病毒经 动物体传代一次即发生较大变异，文中作者曾依据这些人工嵌合体病 毒的不稳定性导出一个尚待验证的结论：2C基因极不稳定。作者的 结论反证了一个未经细胞适应长期驯化的病毒其遗传稳定性是极差 的。基于前述的该研究的局限性，其毒力基因定位的精确性有待进一 步验证。 针对甲肝病毒遗传稳定性的研究报道也极少见，国内曾有研究人 员尝试对甲肝病毒减毒株的遗传稳定性进行研究，他们将甲肝H2疫 苗病毒在人源细胞连续传代，然后挑选其中三代病毒K7、K15、K18， 定及对比分析，以衡量基因组的稳定性。该研究方案中缺少对甲肝病 毒毒力基因的稳定性研究的设计，可能与当时尚无甲肝病毒毒力基因 定位的较系统的资料有关，甲肝病毒毒力基因定位的资料一直等到上 述文章发表几年后才由国外同行公开。终上所述，因该研究缺乏对甲 肝病毒毒力基因的稳定性的系统研究，从而导致该研究所获结果在实 际评价甲肝减毒活疫苗遗传稳定性时其意义不是太大。 本研究小组在甲肝病毒的细胞适应性培养方面有丰富的积累，曾 开发出在国内广泛使用的H2减毒活疫苗。本文拟以甲肝病毒为模型， 研究RNA病毒在特定已知条件下的分子进化，其目的是使病毒在细 胞中的适应过程可视化，并以获得的分子进化的资料辅助解决甲肝活 疫苗病毒株选育工作中的技术问题。本研究小组查阅了大量的相关文 献，对实验方案的选取做了诸多分析抉择，最终决定通过对甲肝病毒 野毒在人源二倍体细胞进行系列的连续细胞适应传代培养，其问选取 其中多个经细胞适应的子代病毒进行全基因组核苷酸序列分析，并参 照彦列分析结果选择其中某代子病毒进行动物试验以考核经细胞适 应后的子代病毒的毒力。对实验结果进行总结分析后可获得甲肝病毒 1 浙江大学博士学位论文 在细胞上连续适应传代培养过程中的分子进化数据，其中最重要的是 获取病毒在细胞适应过程中发生的关键事件如细胞适应性改变、毒力 改变的精确时序，其后尝试将病毒内在基因的变异与外在因素变化进 行关联。在获得该完善的分子进化数据之后我们可以系统地研究病毒 在适应细胞过程中的遗传稳定性，同时在确定病毒基因组稳定的前提 下，该分子进化的数据还可以帮助我们对甲肝病毒毒力基因进行较精 确的定位分析。本研究的一个关键点在于序列测定方案的确定，本文 计划采用PCR产物直接测序法，这样可以排除甲肝病毒基因组多态 性以及耐热核酸扩增酶掺入错误等带来的干扰。 本研究分为二部分。 浙江大学博士学位论文 甲型肝炎病毒在人源二倍体细胞的分子进化研究 博士研究生 唐彩华 导师 毛江森院士 摘 要 分子进化研究可以帮助病毒学家了解病毒在已知限定条件下进化 时所发生的分子事件。我们计划以甲肝病毒为模型，研究病毒在人源 二倍体细胞长期连续传代过程中的进化热点、进化时序、进化方向等。 本文中，我们将甲肝病毒