甘蓝型油菜BnPPT1基因的克隆及其功能研究.pdfVIP

andFuctional Cloning ofBnPPTlGene Study InBrassica Napus ADissertation Submittedtothe Committeeof Normal Zhej iang University Forthe of Degree MasterofScience ByYangKun Supervisedby Chen prof．JinQing April，2010 甘蓝型油菜BnPPTI基因的克隆及其功能研究 摘要 translocator J． P尸丌)是细胞质体碳水化合物转运的一个关键基因，在植物莽草酸代谢和脂肪酸生物 合成途径中起着重要作用。根据模式植物拟南芥PEP转运子AtPPTl基因序列与油菜数 据库BBSRC napus)幼 嫩叶片基因组DNA和种子eDNA为模板，克隆甘蓝型油菜PEP转运子基因全长序列， 同源性很高，仅有个别氨基酸的差异；进化分析结果进一步说明两者近亲缘关系。以 蛋白亚细胞定位观察以及功能表达验证；亚细胞定位分析结果表明BnPPTI基因编码蛋 载体BPTi的转基因拟南芥表现出内源基因彳，尸尸丌的表达抑制，出现了明显的低叶绿 具有相同的生物学功能，由此推测在甘蓝型油菜中，B玎胛丌基因具有提供油脂／蛋白质 生物合成的重要底物PEP这一十分重要的生物学作用。采用半定量RT-PCR分析表明， BnPPTI基因在油菜各器官中表达差异很大，在幼嫩的子叶、茎以及中早期发育时期种 子中有较高丰度的表达，在种子中表达丰度随发育时期逐步升高。但在成熟后期没有 表达，暗示该基因在油菜籽粒油份等物质积累中有重要功能。因此，通过农杆菌转染 油菜下胚轴的技术，将构建好的BPE载体导入了本研究室前期获得高油份甘蓝型油菜 中，PCR检测以及除草剂抗性筛选表明成功获得了转基因阳性株系32份；To代单株套 袋成熟种子油份以及脂肪酸成分的测定结果表明转基因To代植株油份分布出现类似iF 念分加巾，J趋势，与转基因刚性对照41I比，脂肪酸组分没有明显变化，而}Ill份含量有所 摘要 增高，最高增加了10．5个百分点。这些To代植株出现类似『F态分布的油份分布趋势说 明，目标基因在不同转基因油菜中基因表达差异明显，个体性状分化较大，为进一步 明确目标转基因的功能，并为转基因材料提供可靠的分子身份，本论文综合反向PCR 法在其它物种上的成功报道，对反向PCR法的几个关键条件进行了优化，成功分离克 隆了l份高油转基因油菜外源T-DNA的侧翼序列。这些结果为进一步深入研究和应用 BnPPTI基囚在提高油菜籽粒含油量奠定了峰实的基础。 关键词甘蓝型油菜，BnPPTl，基因克隆，转基因，功能研究，侧翼序列 ABSTRACT