应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞_百替生物.pdfVIP

应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞 沈怡 陈汉平 马庭元 从孕妇外周血中分离胎儿细胞并进行遗传性疾病的检测，具有十分重要的临床价值。 为了避免大量的母血细胞对胎儿细胞检测的干扰，必须对母血中的胎儿细胞进行分离富 集。本研究采用流式细胞技术对36 例孕妇外周血中的有核红细胞(NRBCs)进行分离纯化， 初步探讨NRBCs 在母血中的含量及与孕周的关系。 一、资料与方法 1.标本来源： 选择1997 年10 月至1998 年6 月在我院行产前检查的健康妊娠妇女 36 例(妊娠组)，年龄21～28 岁，孕周12～27 周，均为第1 次妊娠，无严重贫血（血红 蛋白90 g/L）等妊娠合并症或并发症。对照组分别选择健康未孕妇女10 例(未孕组)，年 龄为21～25 岁，我院1998 年1 月至6 月出生的新生儿10 例(脐血组)。每次采血5 ml。 2. 实验方法：（1） 标本制备：抽取肘前静脉血，按常规方法分离，获得单个核细 5 胞层。普通光学显微镜下计数细胞总数。（2）直接免疫荧光染色：按1×10 /μl 比例加 入异硫氰酸(FITC)标记的CD71 单克隆抗体（华美生物公司产品，为鼠IgM），孵育30 min 后重悬于0.5 ml 磷酸缓冲液中。（3）分选CD71 阳性细胞：FACSort 型流式细胞仪为美 国Becton-Dickson 公司产品。样品测试前，先用标准荧光微球校准仪器。设定分选参数， 将标记好的细胞用聚合甲醛固定后上机分选。（4）观察项目：收集分选细胞离心后，制 成滴片直接置于荧光镜下。找到阳性细胞后，将玻片干燥再行Wright′s染色，置于普通 光学显微镜下观察其形态学特征。显微镜为日本产Olympus 荧光显微镜。 3.统计学处理：采用t 检验。 二、结果 1. CD71 阳性细胞分布：根据视窗中前向角散射（FSC）、侧向角散射(SSC)及细胞大 小，细胞颗粒性可分为3 个区域：低度FSC,SSC 为红细胞，中度为淋巴细胞，高度为粒细 2 3 胞。NRBCs 位于中度区域，荧光强度在10 ～10 区域。 2. NRBCs 的富集及染色情况：荧光镜下标记上CD71 单克隆抗体的细胞膜表面呈现绿 色荧光，此类细胞为阳性细胞。将流式细胞仪分选后的细胞滴片，置于荧光显微镜下观察 发现，妊娠组的阳性细胞极少，再将其涂片行瑞氏染色，发现细胞体积较淋巴细胞大，胞 浆呈淡蓝色，胞核大而浓染，胞核与胞浆比约为2∶1。符合NRBCs 的形态学特征。而脐 血组阳性细胞丰富，膜表面荧光强，瑞氏染色符合NRBCs 特征的细胞多。未孕组则未找到 符合上述特点的细胞。 3.CD71 阳性细胞表达情况：妊娠组妇女外周血中CD71 阳性细胞的平均含量为 -2 -2 (0.39±0.26)×10 ，未孕组妇女的CD71 阳性细胞的平均含量为(0.07±0.04)×10 ，而 -2 脐血组的CD71 阳性细胞平均含量高达(3.88±0.75)×10 。妊娠组与其他两组比较，差异 均有极显著性(P0.01)。 4.CD71 阳性细胞在外周血中的比例与孕周的关系：孕12 周至17 周，CD71 阳性细胞 -2 -2 -2 的含量从0.11×10 升至0.64×10 ，孕19 周后逐渐降为0.22×10 。 三、 讨论 1. 流式细胞仪分选NRBCs:有研究表明，20 ml 母血中仅含0～20 个胎儿细胞，用于 产前诊断的唯一途径是对胎儿细胞进行富集［1］ ［2］ 。近年来流式细胞仪分选功能的不断完善 。 脐血的CD71 阳性细胞含量最为丰富，这与脐血富含NRBCs 有