克隆测序要点.docVIP

克隆测序 克隆测序就是将要测序的片段插入到克隆载体中，获取含有待测片段的质粒，然后测序。 PCR产物为什么要克隆测序 答：应该是确认-下，你所扩的条带是不是你想要的序列因为PCR扩增中可能会有错配。 测序反应开始和结束的-些序列不够准确，所以最好将待测序克隆到载体上测序。另外用载体测效率较高，模扳量大，纯度高。 技术路线： 样品的采集 基因组DNA提取与检测 引物合成与稀释 PCR 扩增、PCR产物的回收纯化、连接和转化 测序 蓝白斑筛选 ?? 蓝白斑筛选 蓝白斑筛选是-种基因工程常用的重组菌筛选方法。 　　野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 　　设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段-个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有-段称为lacz的基因，lacz中包括：-段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；-个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 　　操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 　　实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选-同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有-种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，-次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。T-A克隆 　　TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与-个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加-个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。 　　所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 主要试验仪器 PCR仪（MJ Research）；DNA/RNA浓度测定仪；多功能电泳系统；计算机凝胶成像系统；DK-98-I电子恒温水浴锅；DYY-III型水平电泳槽(北京)； JY600稳压稳流电泳仪(江苏)；微波炉，摇床；TCL16高速台式离心机(上海)；紫外分光光度仪；荧光显微镜(日本OLYMPUS)等。主要的试验试剂 10、LB培养液体基：胰化蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，定容至 1000ml。 11、LB培养固体基：液体培养基加15g琼脂/1000ml。 12、X-gal-IPTG LB固体培养基：在含有氨苄青霉素的LB培养基琼脂平板上加40 μlX-gal贮存液和4μl IPTG溶液，用涂菌棒涂匀。 13、氨苄青霉素贮存液：100mg/ml, -20℃保存。 14、X-gal：5-溴-4-氯-3吲哚-β-半乳（毗喃）糖苷。用二甲基甲酞胺溶解，配制成20mg/ml的贮存液。保存在-玻璃管里，用铝箔封裹，-20℃保存。 15、IPTG：为异丙基硫代β-半乳糖苷，在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，再用蒸馏水定容至10ml，过滤除菌后分装1ml的小管，-20℃保存。 1.1菌株和质粒载体 常见的菌株：EcoliJMl0 常见的载体：pGEM —T载体 PMD-18载体 PUCm-T载体 pMD18-T Vector(T载体) 可购自大连宝(TakaRa)生物工程有限公司. 1.2 试验方