兽医生物制品专题报告课件1.pptVIP

生物制品生产中支原体污染的检测，清除和预防 两个“词语”解读 污染：支原体是生物制品中常见的一种污染微生物，工作环境、操作者本身、培养基、污染支原体的细胞、试验器材和用来制备细胞的原始组织或器官都可能给生产带来支原体的污染。 危害：生物制品一旦污染支原体，会引起质量下降，免疫效果得不到保证，严重时可造成人力、物力、财力上的巨大损失，不但不能使生物制品达到预期效果，反而给机体带来疫病。 1 支原体的特点 ?支原体是最小能够自我复制的原核生物，其大小介于细菌和病毒之间。 ?结构简单，无细胞壁，形态多样，可通过细菌滤器。 ?对一般抗生素不敏感。 ④多数支原体污染比较隐蔽，显微镜下观察，可见单个荷包样菌落。 3 支原体的清除 一般在生物制品中，一经发现有支原体污染，最好是及时灭活弃之。但对于一些无可替代或不可复得的珍贵细胞系和种毒等被污染还应尽力考虑支原体的清除。 2 3.1 清除支原体方法的优缺点比较 表2.比较了几种常见去除支原体的方法，几种方法各有优劣，单独应用时均不够理想，实际应用中多是根据所污染支原体的种类，采用适宜的一种或几种去除支原体的方法相结合，以达到最终清除支原体的目的。 4 支原体污染的预防 支原体污染源可能存在于生产的各个细节：工作环境、操作者、培养基甚至细胞的交叉污染。这就要求生产及检验过程中严格遵循生物制品生产及检验规范，从自身做起，养成良好的工作习惯。 良好的工作习惯 强化个人卫生，进入洁净区域必须进行冲凉和更换无菌工作服，做到洁净区的生产人员无裸露皮肤暴露在生产环境中。同时在生物制品生产过程中，所有的操作必需规范，杜绝任何小的操作细节，例如操作过程中手离开操作台、进入操作台的器械或器皿没有进行消毒、用手擦汗或接触到裸露的皮肤可能导致的支原体污染。 培养法 通过将样品接种到支原体培养基上观察液体培养基的颜色变化和固体培养基上是否长有支原体菌落来判断试验结果，准确率高，一般支原体都能检出，但此种方法培养时间长，需29d才能出最终结果。一般用于对种毒和成品的检测。 试验步骤 （1）样品检验：病毒性活疫苗取样3-5瓶，如冻干制品则用液体培养基恢复到原量，混合后取5ml接种到小瓶培养基，再从小瓶中取混悬液0.6m1分别移植到2支小管、2个固体平皿培养基。小瓶、小管培养物放置37℃培养，平皿培养物放含5%CO2、37℃培养箱培养。每日观察培养物颜色有无变黄或变红的变化。5、10、15d分别从小瓶中取0.6ml培养 物分别移植到2支小管、2个平板培养基。每次移植的小管和平皿需培养观察14d，在观察期内发现小瓶或任何1支小管颜色有变化，立即移植到小管和固体培养基，观察液体培养基是否出现恒定的pH变化及固体培养基上有无菌落出现。 （2）对照：每次移植培养的同时设阴阳性对照。 试验结果 阴性对照无支原体生长，阳性对照液体培养基变黄，固体培养基有支原体菌落生长，则检验结果有效。固体培养基无菌落生长，则判定样品无支原体污染。 PCR方法 根据支原体基因序列及其细菌基因序列就同源性对比分析，设计合成4条引物，如下： Z-1:GAGGGGAGCAAAYAGGATTAGATACCCTGGT Z-2:TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTCCAC Z-J:ACCATGCACCACCTGTCATTGGGTTGACCTCCA Z-Z:CCATGCACCATCTGTGATCTCGTTAGCCTCGGC 用该引物扩增标准株支原体，在相应范围形成特异性条带，若PCR检测结果为阳性，则判定生物制品为支原体感染。 * 主讲人：肖裕章 主 编：杨 慧 主 审：张广荣 12药学出版社 支原体检测的方法 分离培养法、DNA荧光染色法、电镜法、血清学方法以及核酸探针法 培养法 PCR扩增法 *