基因敲除动物模型的建立.pdfVIP

维普资讯 徐州医学皖学报 ACTA AC~MOEMIAE MEDICINAE XUZHOU 2OO2，22(1) ·91· 基因敲除动物模型的建立 朱孝荣，薛 猛 (扬州大学比较医学中心，江苏 扬州 225009) 摘要：随着基因敲除和胚胎干细胞(Es细胞)技术的发展，在生命科学的许多领域都已建立了基因敲除动物 模型。基因敲除动物模型的建立主要是用Es细胞作为材料，通过外源基因同源重组技术将 细胞中某段基因 置换出来，然后将此 细胞注入囊胚中形成嵌舍体，再通过杂交使外源基因纯合。同源重组法应用比较广泛但 存在不足，主要是有些被敲除的基因对动物的胚胎发育至关重要，基因敲除后容易导致胚胎早期死亡。c 1∞ 基因定点敲除系统可解决这些问题，它可 在特定的时间内对特定组织中的基因进行敲除。基因敲除动物模型 在免疫学、人类疾病模型复制和基因功能鉴定等方面都有着广泛的应用。 关键词：Es细胞；基因敲除；动物模型 中图分类号：0812 文献标识码：A 文章编号：1000—2065(2002)01—0091—04 基因敲除技术是在基因定位整合技术(genetat． 到假孕鼠的子宫内，发育成一个嵌合体。经过进一 geting)以及小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemceils，ES 步杂交传代的方法，使外源基因纯合，即建立成基因 细胞)体外培养的基础上建立的一种新兴的生物技 敲除动物模型。虽然线路并不复杂，但由于真核细 术。该技术使转基因技术更前进了一步，为人们在 胞内发生同源重组的概率非常低 ，筛选被整合的细 动物体内分析某一特定的基因提供了有力的手段， 胞就成了关键的问题。为了提高同源重组效率，减 这一必威体育精装版技术最先用于动物模型的复制上，1988年 少后阶段的工作，人们找到几种方法，其中最常用的 人类培育了第 1例基因敲除动物模型，揭开了基因 方法是正负双向选择法 (PNs)、正向选择法和 PCR 敲除动物模型建立的序幕。进入 20世纪 90年代， 法。PNS法，所设计的载体包含 10—15 与靶基因 生命科学的各个领域、各个学科基因敲除动物模型 同源的片断，一个 r一 基因插入到载体同源序列内 都得到广泛的应用 的一个外显子中部，作为正选择标记；在同源区外插 入一个HSV—tk基因作为负选择标记。载体中插入 1 基因敲除动物模型的建立 l／eo基因的主要 目的是打断靶基因的编码序列，整 基因敲除 目前最常使用的是小鼠的Es细胞it·， 合重组细胞的一个选择标记 。因neo基因对 G418 主要是因为Es细胞在体外有白血病抑制因子(LIF) 耐受而成活，反之，ES细胞死亡而淘汰。陬 一tk 的条件下，可增殖并维持多潜能未分化的状态，Es 位于打靶载体的同源序列与非同源序列之间，反向 细胞有利于各种体外操作，具有发育成胚系各种组 选择是根据 同源重组发生时，同源片段末段(HSV— 织 的能力。 tk)将被切除而发生随机整台时，由于tk的存在而使 为了建立基因敲除动物模型，在体外先构建一 醛 细胞被杀死，用这种方法可使同源重组的筛选效 个打靶载体，这个载体上含有一段与欲敲除的基因 率提高2～2000倍不等。正向选择法，主要应用于 具有高度同源性的外源基因。在外源基因中插入一 外源基因在 Es细胞中能被转录的情况。其中插入 带有启动子的选择标记基因，把这个含有修饰后外 的选择标记基因不含内源性启动子，这段序列被导 源基因的载体利用转染的方法，如磷酸钙共沉淀、电 人细胞后，发生同源重组的细胞 由于能为选择标记 转移或逆转病毒介导等方法导人 Es细胞中。这样