生物技术制药7.docVIP

第一章绪论 1.生物技术药物的分类：（1）应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂；（2）基因药物：如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物、核酸酶；（3）来自动物/微生物的天然生物药物；（4）合成与部分合成的生物药物。 2.生物技术制药的特点：（1）高技术：表现在其高知识层次的人才和高新技术手段；（2）高投入：主要应用于新产品的研究开发及医药厂房的建造和设备仪器的配置方面。（3）长周期：实验室研究阶段中试生产阶段，临床试验阶段（ⅠⅡⅢ期），规模化生产阶段，市场商品化阶段及监督每个环节的严格复杂的药政审批程序等。（4）高风险（5）高收益。 3生物技术药物的特性：①分子结构复杂②具有种属特异性③治疗针对性强、疗效高④稳定性差⑤基因稳定性⑥免疫原性⑦体内的半衰期短⑧受体效应⑨多效性和网络性⑩体验的特殊性 第二章 基因工程制药 1基因工程药物制药的主要程序：获得目的基因，组建重组质粒，构建工程菌（或细胞），培养工程菌，产物分离纯化，除菌过滤，半成品鉴定，成品鉴定，包装。 2目的基因的获得：（1）逆（反）转录法：mRNA的纯 化→cDNA第一条链的合成→cDNA第二条链的合成→ cDNA的克隆→将重组体导入宿主细胞→cDNA文库的 鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴定（有核酸探针杂交 法和免疫反应鉴定法）（2）反转录——聚合酶链式反应 法：利用逆转录和聚合酶链式反应，该方法是在mRNA 反转录形成cDNA第一链后，不再合成cDNA第二链， 而是在特异性引物作用下，利用PCR法进行扩增，特异 的合成目的cDNA链。（3）化学合成法：较小的蛋白质 或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目 的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 3质粒的不稳定可分为：（1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不寒质粒子代菌的现象。常见分裂不稳定的两个因素：①质粒丢失率与宿主菌、质粒的特性，培养条件有关。②含质粒菌/宿主菌比生长速率差异的大小。一般宿主菌在非选择性培养基上具有生长优势。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、却是所致工程菌性能的改变。 4提高质粒稳定性的方法：（1）选择合适的宿主菌：宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒稳定性。（2）选择合适的载体：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒带菌频率高，如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性，高拷贝质粒工程菌产生不含质粒带菌频率低，但对稳定性不利。（3）选择压力：在培养基中加入选择性压力如抗生素，可以提高质粒稳定性，因为不含抗性质粒菌的生长就受到影响，在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。（4）分阶段控制培养：外源基因高效表达，重组质粒越不稳定，所以为了提高稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法，先使菌体生长至一定密度，外源基因表达处于阻遏状态，再诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。（5）控制培养条件：培养条件对菌的比生长速率有很大影响，而基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性也有很大影响，提高比生长速率，能提高质粒的稳定性。调控环境参数如温度、ph、培养基组分和溶解氧浓度。有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。(6)固定化：基因重组E.coli固定化后，质粒稳定性和外源基因表达都有所提高 5基因工程药物分离纯化的流程：发酵液→细胞分离→（胞内产物）细胞破碎→固液分离→包含体→变性→复性→浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品 技术要求：①技术条件温和，保持活性②选择性好，可达到较高纯度③收率要高④两个技术间能直接联系，不需要对物料加以处理⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求 6基因表达之宿主菌选择要求：具有高浓度、高产量、高产率；能利用易得廉价原料；不致病，不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行重组cDNA技术；产物易提纯。常用的宿主菌有原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉素）和真核细胞（酵母和丝状真菌） 7表达载体的特点：①独立复制②灵活的克隆位点和方便的筛选标记③很强的启动子④阻遏子⑤很强的终止子⑥所产生的mRNA具有翻译的起始信号 第三章 动物细胞工程制药 1动物细胞常用培养基分类:：①天然培养基：天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，但是由于天然培养基制作过程复杂，批间差异大。因此逐渐为合成培养基所替代②合成培养基：是人工设计，配置的培养基。今本组分：无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物 葡萄糖 指示剂酚红③无血清培养基：即不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培