单增李斯特菌环介导等温扩增快速检测方法的建立.pdfVIP

中国畜牧兽医文摘 2017年 33卷 第2期 基 础 科 学 单增李斯特菌环介导等温扩增快速检测方法的建立 1，2 2 1 杨爱华 李秀梅 韩文瑜 （1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062； 2.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402） [摘　要] 研究针对细胞增生性李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）hlyA基因设计了4条特异性的环介导等温核酸扩增（loop- mediated isothermal amplification，LAMP）引物，通过优化反应条件，建立了单增李斯特菌的LAMP快速检测方法。特异性和敏感 性试验结果显示，该方法能够特异地检测单增李斯特菌，其最低检测限为3 CFU/mL。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行 判定。LAMP可以快速、直观、准确地检测单增李斯特菌，是一种适合基层现场应用的检测方法。 [关键词] 单增李斯特菌 环介导等温扩增 快速检测 hlyA基因 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要的人 表1 引物序列表 畜共患病原菌和食源性病原菌，人畜在食用了被该菌污染的食物 引物序列 引物序列5’-3’ 引物长度/bp 后，除了出现恶心、呕吐、腹痛等一般细菌性食物中毒症状外， ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT- 还会导致脑膜炎、骨髓炎、败血症、心肌炎、流产等，病死率高 FIP CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG 47 达30%。该菌在自然界分布广泛，4℃的环境中仍可生长、繁殖， TTGCCTGGTAACGCGAGAAA- BIP 38 增加了冷藏食品威胁人类健康的风险，WHO已将该菌列为重点检 TACCGTTCTCCACCATTC 测的食源性致病菌之一，因此，建立快速、准确的检测方法对保 F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA 25 证人类和动物生命安全具有重要意义。 B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA 19 目前，用于单增李斯特菌的检测技术主要有细菌分离鉴定、 免疫学方法和PCR等，但上述方法花费时间较长，而且判定结果 菜碱浓度和反应温度进行优化，具体梯度如下：内、外引物浓 需要借助精密仪器设备，难以在基层生产中普及应用，因此建立 度比分别为：4、6、8、10，外引物终浓度为0.2 μmol·L-1 ，其 -1 一种简单、快速、准确的病原诊断方法显得十分必要。Notomi等 对应的内引物终浓度分别为：0.8、1.2、1.6、2.0 μmol·L ； 于2000年发明了环介导等温核酸扩增技术，该技术依赖4条特异性 Mg2+终浓度分别为2、3、4、6、8、10 mmol·L-1 ；甜菜碱终浓 引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、 度分别为：0.4、0.6、0.8、1.0mmol·L-1 ；反应温度分别为61、 高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列。本试验针对单