第十一章：基因表达和功能研究.pptVIP

基因和它的转录本之间杂交可直接用于基因内含子的研究： 成熟的转录本RNA是不含内含子的，如果要研究的基因有内含子，那么，该基因在长度上要大于它的转录本。基因上内含子由于不能和转录本杂交，就会形成一个“环”，这种环可在电子显微镜下很容易观察到。它们在电子显微镜下显示出一种特别的图像（图11-3）。 在生物体内，并非所有的基因都处于表达状态。 无论是低等生物还是高等生物，通常只有少数基因处于持续地表达状态，而大多数基因是受调控表达的：只有当细胞需要这种基因产物时，它们才被启动。 对于高等生物而言，基因的表达具有时空特性：不同的组织、细胞的基因表达存在差异；即使同一组织在不同的生长发育时期和生长发育状态下，其基因的表达也存在不同。 低等生物中，以大肠杆菌的色氨酸生物合成酶的基因表达为例：当色氨酸在细胞中大量存在时，该基因就被关闭；而当色氨酸浓度降低时就重新被激活。 在高等生物中，基因调控就更复杂，高等生物拥有更多的调控基因。 在基因的上游区域（即编码序列开始前）通常具有一个或几个调控序列（图11-9），调控蛋白（由调控基因编码）可附着于这些序列上，可调控该基因的表达（开启和关闭）。调控蛋白既可以抑制也可以增强基因的表达：调控蛋白的抑制作用可使基因表达减弱或停止；调控蛋白的促进作用能使基因的表达被激活或增强。 11.2.1 基因的调控序列研究 调控序列是位于基因上游的一段DNA，调控蛋白可通过与该段DNA结合，实现对该基因的调控。 依据调控序列与调控蛋白的结合特性，有两种方法可识别基因上游蛋白结合位点调控序列： 一是根据调控序列结合调控蛋白后具有的较高的分子量来辨别蛋白质在一个基因上结合的区域； 二是根据它的抗核酸酶的降解特性，来确定调控蛋白结合的这个区域。 利用调控蛋白及其结合的DNA—分子间可形成复合体，我们可通过蛋白质—DNA、蛋白质—RNA杂交技术研究并识别基因的调控序列。 B、脱氧核糖核酸酶I（DNase I）足迹法 （foot-printing） DNaseⅠ足迹实验（foot-printing assay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。 方法：对要研究的DNA片段在一端用一个放射性基团进行标记，并使它与调控蛋白结合成复合体（图11-13），然后，加入DNase I。使用的DNase I的量要适当，以便使DNA-片段并不完全被分解，而使每一个分子中间仅在一处被切开。在没有蛋白质结合的部位，每个碱基处都有被切开的可能。这样我们就得到一系列的被标记的、在大小上总是相差一个核苷酸（即DNA测序的化学降解法）的DNA片段。 在调控蛋白和调控序列结合的部位，由于受调控蛋白的保护，不能被DNase I分解。因此，在聚丙烯酰胺凝胶中分离后，这些片段系列在放射自显影上显示出片段的不连续性（图11-13c）。 C、修饰干扰实验 前面已提到过，调控序列通常只有几个碱基对，而用DNase I 足迹法检测时，由于同DNA 结合的蛋白质分子较大，可以保护数以十计的碱基对不受DNase I的降解，因此DNase I足迹法也不能很精确定位调控序列（尽管比凝胶阻滞法精确），只能用于定位调控序列所在的区域。修饰干扰实验可用于分析真正和蛋白结合的核苷酸位点。 修饰干扰实验的操作类似足迹法，该方法的核心是：DNA序列中的核苷酸被修饰后蛋白质则不能同该DNA片段结合。首先标记经过限制性酶切的DNA片段的一端，然后用化学试剂来修饰特定的核苷酸：常用的是用硫酸二甲酯在鸟嘌呤核苷酸上添加甲基基团（图11-15）。并且这种修饰是在限制性条件下完成以确保最终每个DNA片段上只有一个核苷酸被修饰。在完成修饰操作后，再将DNA片段和蛋白质混合，当调控序列中的鸟嘌呤被甲基化修饰后蛋白质则不能同该DNA片段结合,通过电泳可分离出此条带。进一步利用能修饰A、T、C等不同核苷酸的其它化学试剂,重复类似鸟嘌呤核苷酸分析过程，可最终逐一确定调控序列中核苷酸的精确组成。 进行缺失分析的关键是找到一种从基因的表达上去研究调控序列的缺失对基因表达的影响的方法。实验中常用报告基因来研究调控序列的功能。a、报告基因：基因的产物或表现型能够明确显示出调控序列的变化对该基因所引起的影响，这样的基因称为报告基因。将报告基因与被研究基因的上游区域连接在一起（图11-12），用报告基因将原来的基因取代。进入宿主生物后，这个报告基因因为受同样的调控序列影响，它的表达形式应该和原来的（被取代）基因完全相同。 报告基因须满足：1、报告基因编码的蛋白质必须为一种宿主生物本