第六章蛋白质工程——自制修改.pptVIP

第六章 蛋白质工程 所有干燥蛋白质均含有 ： C 50%-55% H 6%-8% O 20%-23% N 15%-17% （蛋白质中N的平均含量约16%，1g氮相当于6.25g蛋白质） 某些蛋白质含有： S 0.3%-2.5% 以及P 少数蛋白质含有：Fe、Cu、Zn、Mo和I 等元素 1）氨基酸的基本结构 存在于自然界的氨基酸有300种。动物机体的蛋白质 经强酸水解之后可以得到20 种氨基酸。其中的19 种的中 心碳原子(Cα)除结合一个H 原子外，还分别连接一个氨 基（NH2）和一个羧基（COOH），构成氨基酸的主 链，它们在所有氨基酸中都是相同的。R 称为氨基酸的 侧链，不同氨基酸的区别就是其侧链R的化学结构不同。 a、两性电离 α螺旋主要的结构特点 β迂回  二维电泳荧光染色 二维电泳荧光检测 2D Gel Databases Biobase 角质形成细胞,膀胱癌等 (丹麦Center for Genome Research) http://biobase.dk/cgi-bin/celis ECO2DBASE 大肠杆菌 (在NCBI库中) /respository/ECO2DBASE Heart-2DPAGE 人心肌 (德国柏林) http://www.chemie.fu-berlin.de/user/pleiss HSC-2DPAGE 人类心脏 (英国Harefield, Heart Science Center) http://www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.html LSB 人类,小鼠和大鼠肝脏等 (美国Large Scale Biology) .2dmaps/patterns.html QUESTRef52 细胞,大鼠胚胎,酵母 (美国Cold Spring Harbor Lab) / SWISS-2DPAGE 十个人类图谱,包括: 肝, 浆细胞, 红细胞, 血小板, 以及酵母, 大肠杆菌 (瑞士日内瓦, University Hospital)2-DE数据库http://expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.html Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典Goteborg University) http://yeast-2dpage.gmm.gu.se/ Yeast S. cerevisiae (美国Proteome Inc.) /YPDhome.html 蛋白质组研究应用实例 材料： D、蛋白质组研究的一般过程： 细胞或组织样品 → 样品制备 → 二维凝胶电泳（2D－PAGE）分离蛋白质 → 计算机辅助分析2D－PAGE图象 → 对感兴趣的蛋白质进行酶解 → 质谱分析 → 数据库检索 → 蛋白质鉴定→分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。 整个过程大体上可分为分离、鉴定、分析三步。其中，蛋白质的分离和鉴定是蛋白质组研究技术方面的核心内容，与此相对应的两大核心技术即双向电泳凝胶和质谱技术。??? （一）蛋白质组分离技术 1、双向电泳 双向凝胶电泳是目前蛋白质组最有效的分离方法，又称二维电泳,由O’Farrell和Klose等人于1975年建立并成功地分离约1000个E. coli蛋白。 原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦（IEF）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。 第一相：等电聚焦 根据蛋白质分子的等电点不同进行分离（蛋白质沿pH梯度分离, 至各自的等电点）。 第二相： SDS将等电聚焦后的胶条放在SDS上电泳，使蛋白质分子在垂直的方向上按分子量不同进行分离。 2、凝胶染色 常采用银染和考马斯亮兰染色即可观察到具有许多蛋白质斑点的凝胶图像。也可进行荧光染色等。 大肠杆菌中的蛋白质组图谱 由于具有高分辨率的特点，双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。 该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质粗提物，构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”，分析特定时间与生理状态下蛋白质的表达情况，进行蛋白质组差异比较。? （二）蛋白质的鉴定与分析： 　　 蛋白质在凝胶上被分离后，对于感兴趣的蛋白质点，可经切割、胰蛋白酶水解等处理，形成小的肽片段