第六章基因功能研究技术1.ppt

反义RNA及其在基因表达调控中的作用 反义RNA作用的关键部位 反义RNA作用的关键部位 反义RNA对DNA复制的调控 反义RNA对转录的调控 反义RNA对mRNA加工及翻译过程的调控 反义RNA在细胞不同部位的调控作用 导入反义RNA的方法 反义RNA的构建原理 反义RNA技术在肿瘤研究中的应用 反义RNA技术在抗病毒感染中的作用 RNAi 的发现 RNAi 的发现 RNAi 的发现 RNAi 的发现 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 RNAi 的机理 siRNA RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 机理 RNAi 的技术路线 RNAi发现的意义 外源基因在真核细胞中的表达 一、选择标记和报告基因 选择标记之一二氢叶酸还原酶基因 选择标记之一二氢叶酸还原酶基因 选择标记之二胸苷激酶基因 选择标记之三新霉素磷酸转移酶基因 选择标记之四潮霉素磷酸转移酶基因 选择标记之五氯霉素乙酰转移酶基因 选择标记之六抗除草剂基因 选择标记之六抗除草剂基因 报告基因 报告基因之一β-葡糖醛酸糖苷酶基因 报告基因之二氯霉素乙酰基转移酶基因 氯霉素的结构式 氯霉素催化的反应及检测方法 报告基因之三荧光素酶基因 报告基因之四冠瘿碱合成酶基因 冠瘿碱的检测方法 报告基因之五绿色荧光蛋白基因 GFP的性质 绿色荧光蛋白 The Nobel Prize in Chemistry 2008 二、DNA直接导入的基因转化方法 聚乙二醇诱导基因转化 聚乙二醇诱导基因转化 高压电穿孔法 显微注射法 基因枪法 磷酸钙沉淀法 脂质体载体法 激光微束穿孔法 花粉管通道法 利用载体导入外源DNA 三、农杆菌作载体的植物转基因方法 农杆菌的瘤诱导 农杆菌感染植物形成冠瘿瘤 冠瘿碱 冠瘿碱结构式 Ti 质粒 Ti 质粒的结构 Ti 质粒的结构 Ti 质粒的结构 T-DNA上的基因 T-DNA的边界 Vir区的基因 T-DNA的转移过程 T-DNA的转移过程 农杆菌转基因的载体构建 农杆菌转基因的载体构建 共整合载体pGV3850 共整合载体 共整合载体pGV2260 共整合载体系统的三亲交配 双元载体系统 双元载体系统 小质粒pBin19结构图 三亲交配示意图 农杆菌感染植物细胞的方法 农杆菌作载体的植物转基因方法 农杆菌感染植物细胞的方法 转基因植物的鉴定 四、外源基因转化在基因表达调控研究中的应用 启动子选择 基因构建用于启动子研究 瞬时表达和稳定表达 感染的农杆菌附着在植物细胞表面，并将其Ti质粒上的T-DNA转移进植物细胞内部，整合到染色体DNA上。T-DNA转移时，先以Ti质粒为模板，从右边界开始，合成T-DNA单链，称为T链，T链与virD2及virE2基因产物结合成T复合体，virD2蛋白与T链的5’端共价结合，virE2蛋白是单链结合蛋白，结合在T链上，将T链包被起来。T复合体在其它一些vir基因产物及某些植物蛋白的作用下，进入植物细胞，并进入细胞核。 T链插入到植物染色体DNA中，同时合成其互补链。插入位点是随机的。农杆菌本身并不进入植物细胞，Ti质粒也不进入植物细胞。在用42℃处理杀死冠瘿瘤组织中的农杆菌后，冠瘿瘤组织可在无生长素和细胞分裂素的培养基上迅速生长。 将野生型Ti质粒直接用于植物基因工程存在几个问题：一是野生型Ti质粒太大，难以找到用于插入外源DNA的单一限制酶切位点，不便于操作；二是未改造过的T-DNA转入植物染色体后引起不正常生长，以至不能再生成植株。科学家发现，去除T-DNA上的致癌因子，造成T-DNA大段缺失或在T-DNA上插入外源DNA并不影响T-DNA的转移和整合功能。 对T-DNA区改造的具体方面包括：①切除致癌基因；②增加能插入外源DNA的单一限制酶切位点；③插入选择性标记基因；④装配高效启动子和转录终止信号（可用冠瘿碱合成酶基因的启动子和转录终止信号）。另外，Vir区对T-DNA的转移是通过反式作用因子来实现的，Vir区不一定要与T-DNA区处于同一个质粒上。根据上述因素，先后建立起两个主要的Ti质粒载体系统，即共整合载体系统和双质粒载体系统。 共整合载体（cointegrating vector）pGV3850是由pTiC58 衍生而来，用一段pBR322 DNA取代了T-DNA上的致癌基因，保留了T-DNA的25bp末端正向重复序列及胭脂碱合成酶基因。当带有外源目的基因的pBR322衍生质粒（中间载体质粒，带有选择标记基因如卡那霉素抗性）从大肠杆菌进入农杆菌（此农杆菌已经带有pGV3850）后，两种质粒的pBR322序列间（在农