第六章基因工程及其应用克隆10.ppt

感受态菌: 用低渗冰预冷的CaCl2溶液在0℃时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。 Competent cells: E. coli cells treated with cold Ca2+ solution are susceptible to take up exogenous DNA. CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 感染（infection） 病毒或噬菌体为载体的重组分子，在体外包装成具有 感染能力的颗粒，然后感染适当细胞的过程。 Infection is a method by which recombinant containing bacteriophagum or virus as vector is packaged into infectious bacteriophagum granule or virus and then infects appropriate cells. 基因重组 感染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装及感染 转染（ Transfection ） 由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。 指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA 片段而获取新的表型。 通常将任何类型DNA转移至哺乳动物细胞内的过程均可叫转染. Transfection is a method by which experimental DNA may be put into a cultured mammalian cell. Calcium phosphate (磷酸钙沉淀) Viruse infection ( 病毒感染) Electroporation （电击穿孔） Gene gun （基因枪) Microinjection （显微注射） Liposome （脂质体） 导入受体细胞 方法 methods 目的基因的筛选与鉴定 screening and identifying 根据不同的载体、宿主及外源DNA的性质， 选用不同的筛选和鉴定方法。 The screening and identifying methods depend on vector ,host cells and exogenous DNA 1. 根据载体遗传表型筛选 Selection by genetic properties  利用载体DNA上携带的遗传标记基因筛选转化子或重组子。 Selection with antibiotic resistance 2.α-互补筛选 最常用的β-半乳糖酶基因来自大肠杆菌的lac操纵子，载体中带有大肠杆菌 lac 操纵子的调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酶的序列。用异丙基-β-D-β硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的β-半乳糖苷酶缺陷型进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程称α-互补。 在诱导物IPTG存在下，细菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 培养基的平板上形成蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时，使β- 半乳糖苷酶的氨末端失活，从而不能进行α-互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。 2） α-互补筛选（?-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 N端序列 LacZ酶 Blue-white screening Insertion inactivation of the lacZ gene on a plasmid can be used to screen for recombinants on a plate containing IPTG and X-gal. The X-gal is converted to a blue product if the lacZ is intact and induced by IPTG; hence recombinants grow as white colonies. Recreated vector: blue transformants Recombinant plasmid containing inserted DNA: white transformants Recreated vector (no insert) Recomb