第五章分子生物学研究方法上.ppt

蛋白质等电点 蛋白质的双向电泳技术 Pasteurella multocida P-1059株蛋白组 5.6.2 蛋白质的质谱分析技术 基质辅助的激光解析电力-飞行时间质谱 （337nm） 5.6.3蛋白质印迹技术 DAB:（Diaminobenzidine, 3, 3-二氨基联苯胺) 电转移 5.3.5 基因文库的筛选 通过某种特殊方法从基因文 库中鉴定出含有目的基因片段 的特定克隆的过程。 核酸杂交法 用放射性同位素标记的特 异DNA探针适用于高密度的 菌落杂交筛选。 2. PCR筛选法 PCR筛选法与核酸杂交法具有同样的通用性，而且操作简便，但前提是已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。 3.免疫筛选法 免疫筛选法是基于抗原-抗体特异性结合的原理，所以该法适用于表达型文库的筛选。 5.4 SNP的理论与应用 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因组DNA序列中单核苷酸（A、T、C和G）的变异所引起的DNA序列多态性。 基因组DNA同一位点上的碱基类叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。 5.4.1 SNP的概述 一个SNP表示在基因组DNA某个位点上一个核苷酸的变化，这种变化可能是转换（C?T，在其互补链上则为G ?A），也可能是颠换（C ?A，G ?T，C ?G，A ? T），具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2/3左右。 SNP广泛存在于人类基因组中，其发生频率约为1%或更高。据估计，人类DNA中每300~1000bp就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万~1000万个SNPs。 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型（haplotype），相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传个后代。 例如：玉米储藏蛋白的8个基因型共包含了3个单倍型(H1，H2和H3)，它们分别由多个相邻的SNP所构成。 H2 H1 5.4.2 SNP的检测技术 限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP)、毛细管电泳和变性高效液相色谱（DHPLC）等。由于这些技术都必须通过凝胶电泳进行分析，通量受到限制。 且这些方法仅能判断SNP的有无而不能知道确切的碱基类型，只要进行DNA测序分析才能确认所发现的SNP。 基因分型（genotyping）：利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究，包括基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术（molecular beacon）和焦磷酸测序法等。 1.基因芯片技术（Gene chip） 固相支持介质上进行杂交和原位荧光检测的一种高通量 SNP分析方法。 通过优化芯片杂交程度，使探针只与完全互补的序列能杂 交，而不能与含有错配的碱基的序列杂交。 待测基因样品经PCR扩增及荧光化学标记后与固定的探针 进行杂交。 由于目标基因和探针杂交的程度与荧光强度及种类相关， 因此通过荧光扫描，可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被 检序列的碱基类别。 基因芯片技术 固体平面 (玻片、 尼龙薄膜) DNA样品微点的排列 DNA/DNA or DNA/RNA 碱基配对原则 荧光标记的探针 cDNA芯片制备、工作过程 cDNA 文库 vector PCR 96-well plate 杂交、洗涤、扫描 ……………. ……………. ……………. ……………. ……………. ……………. ……………. ……………. 点制芯片 (机器) Cy5-cRNA Cy3-cRNA 无重复顺序 文库 vector 检测 分析 （2）DNA芯片应用 可在基因组水平进行基因表达、突变、序列测定等，已广泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。 2. Taqman技术 在PCR反应体系中加入2种不同荧光标记的探针，它们分别与两个等位基因配对。探针的5’端和3’端分别用特殊染料标记, 称为供体-受体染料对或引爆-猝灭染料对。正常情况下，由于探针5’端荧光基团和3’端猝灭基团近邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料被猝灭，只要当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。 随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性所切割，致使探针5’端上的荧光集团与3’端的猝灭基团分离，猝灭效应解除，供体的荧光基团被激活，而与模板不能完全配对的探针不能被有效切割，供体荧光基团依然被猝灭。通过相应仪器检测荧光