G6PD缺乏症设计性实验.pptVIP

* 设计性实验 初步判断 1天前食用新鲜蚕豆 据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况——遗传性 恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白脉搏150次/分，血压80/60mmHg，血压下降，呼吸40次/分，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，尿蛋白（++）。 G6PD缺乏症临床表现 正常.红细胞数 4.0～5.5×10^12 /L ，血红蛋白 120～160g/L 患者.红细胞 1.98×10^12 /L，血红蛋白53g/L 正常. 血清总胆红素1.71~17.7μmol/L 结合胆红素1.7~6.8μmol/L，未结合胆红素10.26±6.84μmol/L 患者. 溶血清总胆红素85.5μmol/L 结合胆红素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，皮肤及巩膜黄染 (溶血性黄疸） 急性溶血的证据 半个月内有食新鲜蚕豆史 急性溶血的证据 G6PD缺乏症临床表现 遗传性：患者姐姐曾有此情况 诊断依据 明确诊断 . G6PD缺乏之检测实验 . G6PD检测实验 实验方法:G6PD比值法 主要试剂：抗凝全血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）、 终止液、 试管、移液器 主要仪器：752分光光度计、水浴箱 终止液：是一种阻止（生化试剂）化学反应继续进行的一种试剂，例如ELISA酶联免疫实验结果出来后由于显色剂和残留酶标液作用，反应还在继续进行中，会影响实验结果数值，就需要终止液的作用了。 　　终止液一般用强酸或者强碱做主要配方，常用的终止液一般为2m HCl和2m H2SO4。 .实验原理. 人红细胞戊糖代谢的关健酶G6PD催化G6P转化成6PG时，伴有NADP转化成还原型辅酶II（NADPH）。因此测试NADPH的量反映了G6PD活性。但单测G6PD活性不能排出其他原因引起的G6PD活性升高或降低（如红细胞增多症，标本吸量不准确，贫血，标本溶血，凝血，陈旧，污染等）。测试红细胞戊糖代谢的另一同功酶6PGD，有将NADP转化成NADPH的作用，通过两酶活性比值计算G6PD / 6PGD，可判断G6PD是否缺乏。 实验操作流程 1、取抗凝全血15μl，加入双蒸水200μl制成溶血液。分别取溶血液50μl加入1,2号试管中 2、取G6PD和6PGD反应试剂各50μl，分别加入1,2号试管中，混匀，立即置37℃水浴箱准确保温20min 3、取出试管，立即加入终止液2ml，以蒸馏水作为空白对照，于650nm波长读取1，2管的光密度值（S1和S2） 4、比值计算：G6PD/6PGD=S1/S2 5、正常参考值：1.0~2.3 注意事项： 准确设置水浴箱温度，温度过高会破坏酶的活性，影响实验结果 取出试管后要立即加入终止液，否则反应继续会影响实验数据 结果分析： G6PD/6PGD=S?1?/S?2?，正常参考值：1.0~2.3 ，比值1.0判为G6PD缺乏。 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 ： 蚕豆病患者在食用蚕豆后会出现中毒症状，出现恶心、呕吐 由于红细胞破裂，运氧供养障碍，导致呼吸急促，脉搏微弱而快速；血压降低 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 ： 临床表现：面色苍白，血尿 ,恶心呕吐，排尿呈酱油样色，呼吸急促，神清，萎靡，皮肤及巩膜黄染 实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。 利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基因位点。 正常参值：红细胞数 4.0～5.5× 10^12 /L ，血红蛋白 110～160g/L ，而此时红细胞破裂产生全身溶血性反应，红细胞大量破裂释放出血红蛋白，因此患者红细胞 为1.98×1012/L，有明显下降；由于红细胞破裂，血浆游离血红蛋白显著增高，超过结合珠蛋白的量和肾小管再吸收功能，出现酱油色的血红蛋白尿，而血红蛋白53g/L，降低 红细胞大量破坏，在单核-吞噬细胞系统产生胆红素过多，超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆红素的能力，造成血液中未结合胆红素浓度明显增高，发生溶血性黄疸,皮肤及巩膜黄染 ，尿胆红素(－) 。肝对胆红素的摄取、转化、排泄增多，过多胆红素进入胆道系统，肠肝循环增多，使得尿中尿胆原和尿胆素含量增多，故尿胆素原(+) *