实验三：细胞融合与培养细胞的形态观察和计数.pptVIP

实验六：细胞融合与培养细胞的形态观察和计数 1.掌握培养细胞的计数方法。 2.掌握细胞融合的实验方法及融合率的计算。 3.熟悉体外培养细胞的形态和生长状态的观察和判定方法。 2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象,称为细胞融合(cell fusion)。细胞融合的主要方法有病毒法,聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法。 细胞融合的结果,产生2类多核细胞。一类细胞中含有来自同一种亲本的核,称为同核体;而另一类细胞中含有来自两个亲本的核,称为异核体。 仪器、材料与试剂 (一)仪器 光学显微镜,离心机,37℃恒温水浴锅,CO2培养箱,超净台,倒置显微镜等。 (二)材料 新鲜鸡红细胞,Hela细胞,无菌注射器(1mL,5mL),6号针头,刻度离心机,试管,载玻片,盖玻片。 (三)试剂 50％PEG(Mr1000-6000),Hank,s液,甲醇,Giemsa染液,碘酒,75％酒精。 实验步骤 (一)细胞融合 1.在鸡翼下取新鲜静脉血,以0。85％生理盐水1500r/min、5min,离心洗涤2次,用Hank,s液调节鸡红细胞浓度为107个/mL,取5mL备用。 2.在超净工作台操作:用胰蛋白酶消化处于对数生长期的Hela细胞,以1500r/min的转速离心5min,弃上清液,用Hank,s液调节Hela细胞浓度为106/mL, 取5mL备用。 3.按附录 制备50％PEG(体积分数),置于37℃恒温水浴锅中备用。 4.取上述鸡红细胞悬液及Hela细胞悬液各5mL,混合2种亲本细胞后,取出混合液0。2mL,用Hank,s液稀释5倍,作对照。 5.取出对照后,将其余混合液以1500r/min离心5min,小心弃去上清,余下0。1mL液体,用指弹法将细胞团块弹散。 6.逐滴加入在37℃下预热的50％PEG溶液0。5mL,在90s内连续滴完,边加边轻轻摇动混匀,待PEG全部加入后静止70s。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。 7.缓慢滴加9mLHank,s液以终止PEG的作用,在37℃水浴中静止5min。 8.以1500r/min离心5min,弃上清后,余下0。1mL液体,用指弹法将细胞团块弹散,加入适量Hank,s液,调节细胞浓度。 9.取融合后的细胞悬液和对照细胞悬液各滴3张片,制成涂片,迅速干燥,将细胞涂片置于甲醇中固定10min,取出后晾干,Giemsa染液进行染色,水洗、干燥,待镜检。 10.也可将融合后的细胞悬液和对照细胞悬液分别滴于载玻片上,加盖玻片后,在显微镜下进行直接观察。 实验报告 1.先观察对照组,从形态上识别2种亲本细胞并观察其中有无融合细胞;再观察实验组,找出融合后的多核细胞,双核细胞,并区分同种融合与异种融合细胞。 2.画出观察到的实验组和对照组中典型的各类细胞形态。 3.总结实验过程中的经验或不足。 (二)培养细胞的观察与计数 1.学会实验细胞计数板计数细胞。 2.学会使用倒置显微镜观察培养细胞。 3.熟悉培养细胞生长状态的判定标准。 体外培养生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。 1.取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干. 2.取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡. 3.在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数 * * 实验目的 实验原理 实验步骤 实验步骤 实验步骤 实验目的 实验原理 实验步骤 *