第二次课第二章_DNA重组的克隆操作课案.ppt

基 因 工 程 GENE ENGINEERING 2 DNA重组克隆的单元操作 绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子，其功能是： （1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。 （ 2）为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 （ 3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。 2.1 DNA重组的载体 基因工程载体必需具备的4个基本条件 具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一限制性内切酶位点。 具有合适的选择标记基因。 2.1 DNA重组的载体 2.1 DNA重组的载体 2.1.1 质粒载体 质粒（ Plasmid）是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体 DNA而自主复制的共价、闭合、环状 DNA分子（ Covalently Closed Circular DNA），也称为 cccDNA，其大小通常在 1-100kb范围内。 2.1 DNA重组的载体 2.1.1 质粒载体 2.1.1.1 质粒的基本特性 1、自主复制性 已知的绝大多数质粒都是双链闭合环状DNA分子。除了酵母的杀伤质粒是一种RNA分子外，其他已知的所有质粒无一例外地都是DNA分子。 质粒 DNA含有自己的复制起始位点（ Origin，简称 ori）以及控制复制频率的调控基因，有些质粒还携带特定的复制因子编码基因，形成一个独立的复制子结构（ Replicon）。 2、可扩增性 3、不相容性 严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～5个 松驰型质粒：其拷贝数较多，一般30～50个，多的可达200～300个 。 具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称为质粒的不相容性。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉。 具有不同复制子结构的相容性质粒，尽管它们由于复制机制不同而造成各自的拷贝数有差异，但在细胞分裂时，每种质粒在两个子细胞中均可保持等同的拷贝数，因而它们可以稳定地存在于同一受体细胞中。 4、可转移性 结合型质粒（conjugative plasmid）又叫自我转移型质粒，其分子量一般都比较大，除携带自主复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。 非接合型质粒(nonconjugative plasmid)又叫不能自我转移型质粒，其分子质量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信息，但不携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。 2.1.1.2 质粒的改造与构建 （ 1）删除不必要的 DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA片段的装载量。大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定； （ 2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数； （ 3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞； （ 4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列， 即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以 便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入； （ 5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 理想质粒载体的必备条件 1、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 2、具有若干限制性内切酶的单一酶切位点。 3、具有两种以上的选择标记基因。 4、缺失mob基因。 5、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 2.1.1.3 常用的质粒载体 （一）克隆质粒 用于克隆和扩增外源基因。 具有更小的分子量（2 686bp） 具有多克隆位点 1、 pBR322质粒及其派生质粒 2、 pUC系列质粒载体 具有更高的拷贝数。 可用组化方法筛选重组体，更方便、更省时。 （二）测序质粒 这类质粒通常高拷贝复制， 并含有多酶切口的接头片段， 便于各种 DNA片段的克隆与扩增，在多酶切口接头片段的两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，使得重组质粒经碱变性后，即可进行 DNA测序反应，如 pUC18/19系列；另一种测序质粒是M13噬菌体 DNA与质粒 DNA的杂合分子，如 M13mp 系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链 DNA形式分泌到细胞外， 克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。 （三