分子遗传学第六章.pptVIP

第一节 DNA的复制 意义 复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。1958年Meselson利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。 半保留复制(1958)用同位素15N实验证明 将大肠杆菌培养在以15NH4Cl原来的亲代分子为惟一氮源的培养基中，经多代之后，细胞内所形成的DNA都为15N所标记收集细胞并抽提出DNA，然后进行氯化铯平衡密度梯度离心。这时DNA形成单一的浮力密度为1.724g／ml的条带，而对照是在普通14N培养基中生长的大肠杆菌，其 DNA浮力密度较低，为1.710g／ml。 现在将15N氮源培养的大肠杆菌转移到含14N的培养基中生长，每隔一段时间取样测定DNA的浮力密度。 经一代之后，DNA只出现一条区带，浮力密度为1.7l7g／ml，位于15N—DNA和14N—DNA之间，这条区带的DNA是由14N／15N—DNA组成的。 经二代之后，出现两条区带，其浮力密度分别为1.710g／ml和1.717g／ml，即一条区带为14N ／ 14N —DNA，另一条区带为14N ／15N -DNA。再继续培养， 14N / 14N —DNA分子逐渐增多，而14N ／15N—DNA分子所占的比例逐渐减少。 3、DNA复制的化学 DNA合成的底物是脱氧核苷5’－三磷酸（dNTP）：dATP，dGTP，dCTP和dTTP。 复制的机制涉及到生长链的3’－OH对与模板上的碱基互补的dNTP的α－磷酸基团进行亲核进攻，释放出焦磷酸。 聚合反应所需的能量来源于dNTP和焦磷酸的水解。 ㈡、复制起点和复制方向： 9 bp基序共有4个拷贝，分散于整个OriC的范围内，它是DnaA蛋白的结合位点。通过DnaA蛋白与OriC的相互作用以及DnaA蛋白之间的相互作用，大约30个DnaA蛋白结合在复制起始区。 DNA分子在DnaA蛋白复合体上的缠绕，产生的扭转张力,导致双螺旋在串连排列的3个富含AT的13 bp基序处解开。 DnaB蛋白是解旋酶（Helicase），其作用是解开DNA双链。 两个DnaB蛋白在复制起点处分别与两条单链结合，并按5’→3’相向而行打开DNA双链。 在复制起点处DNA双链打开以后，DnaA蛋白便会募集由6个DnaB和6个DnaC构成的复合体与起始位点处的单链DNA结合。DnaC为DnaB蛋白装载因子。 然后，DnaC催化DnaB蛋白解环，并套在单链DNA上。在DnaB和DnaC蛋白复合体中，DNA解旋酶保持非活性状态。DNA解旋酶向前运动，在其身后留下单链DNA模板。 接着单链结合蛋白（single-stranded binding protein, SSB）与解旋酶解开的单链结合，其作用是防止单链降解，阻止单链退火。SSB蛋白与单链DNA的结合有协同效应，即一个SSB的结合会促进另一个SSB与单链DNA的结合。这种协同结合使单链DNA被解旋酶释放出后，很快被SSB所覆盖。一旦被SSB覆盖，单链DNA即处于伸直状态，有利于其作为模板进行DNA合成或RNA引物的合成。 在大肠杆菌细胞中，DNA解旋酶募集一个引物酶。引物酶负责合成一段短的RNA引物。 二、复制的酶系统 1 DNA聚合酶 1.1 大肠杆菌的DNA聚合酶 1.1.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ，DNApolⅠ1957) 1）理化性质： 一条多肽链组成，单亚基，约含928个氨基酸残基，MW为109KD。编码此酶的基因polA.每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。 每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。 2）功能特点： [1] 5′→3′聚合活性: [2] 3→5外切酶活性──校对作用: [3] 5→3外切酶活性──切除修复作用: DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5′→3′方向移动，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换，这种反应叫做切口翻译 [4] 5→3内切酶活性 经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为68KD，小片段的分子量为35KD。 小片段可在体外用于合成反应。它具有DNA聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。 DNA聚合酶的5→3聚合活性 1.1.2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)： 1）理化性质： 此酶MW为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%。 2）功能特点： 该酶具有5′→3′