重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达.docVIP

　　重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达 作者：陈睿 刘雪平 郭春红 孙志军 【摘要】 　　目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67，检测基因在细胞中的表达。方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2EGFP基因，测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接，构建重组逆转录病毒质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。EcoR I酶切鉴定重组质粒。脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度。流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达。结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带，测序证实，获得正确的人GDNF序列和EGFP序列。经EcoR I酶切鉴定，成功构建重组质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达，流式细胞仪检测转染效率为24.4%。结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSNIRES2EGFPGDNF质粒。基因转染包装细胞PT67获良好表达。 【关键词】 胶质细胞源性神经营养因子；逆转录病毒；脂质体；基因转染 　　帕金森病(PD)临床疗效不佳,有学者将骨髓间充质干细胞（MSCs）定向移植入PD鼠模型的黑质纹状体区，发现其能够存活并分化为酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）表型神经元，从而改善PD大鼠症状，但不能阻止神经细胞的进一步死亡。于是有学者探索将神经营养因子体外转染靶细胞，通过立体定向的方式移植入鼠的黑质纹状体区，发现可促进PD大鼠的黑质纹状体神经通路的结构和功能的恢复。本课题拟在以上研究的基础上，应用人胶质细胞源性神经营养因子（glial cell linederived neurotrophic factor, GDNF）重组逆转录病毒体外转染MSCs，立体定向移植入PD大鼠模型的黑质纹状体区，通过对相应指标的测定,分析逆转录病毒介导GDNF基因转染MSCs移植 治疗 PD的可行性及其疗效。本文为实验的第一部分，旨在构建一个携带有治疗基因GDNF同时携带报告基因加强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protEin,EGFP)的逆转录病毒重组质粒，转染包装细胞PT67后，检测基因的表达及转染效率，为下一步转染MSCs、进一步深入探讨GDNF基因在神经系统疾病基因治疗中的作用奠定基础。 　　 1 材料与方法 　　1.1 材料、试剂和仪器 　　人神经胶质细胞瘤标本,由山东省立 医院 神经外科提供。逆转录病毒载体pLXSN质粒、携带pIRES2EGFP基因片段的质粒、PT67、NIH3T3细胞由山东省立医院中心实验室保存并提供。PCR试剂盒、pMD18T载体试剂盒、限制性内切酶Xho I、BamH I、Bgl Ⅱ、EcoR I、T4连接酶均购自大连TAKARA公司；中量质粒抽提试剂盒购自Omega公司；GDNF基因片段及pIRES2EGFP基因片段上、下游引物，由上海博亚生物技术有限公司合成；Lipofectamine 2000、OptiMEM无血清培养基购自Invitrogen公司；G418、DMEM培养液购自Gibco公司；Polybrene购自Sigma公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 GDNF基因、IRES2EGFP基因的克隆及测序 　　参照《分子克隆实验指南》，从人神经胶质细胞瘤组织中提取总RNA后逆转录生成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增GDNF基因片段。同时，以含有IrES2序列及EGFP基因片段的质粒为模板，PCR扩增EGFP基因片段。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，10个循环；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，20个循环；72℃ 7 min充分延伸；4℃,保持。GDNF基因引物序列（上游5′TACTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG3′，下游5′CGAGATCTTCAGATACATCCACACCTTTTAGC3′）；IRES2EGFP基因引物序列（上游5′TTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′，下游5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′）。引物设计时分别引入Xho I、BamH I、Bg Ⅲ酶切位点。扩增产物纯化回收后克隆入T载体，筛选阳性克隆，使用测序仪进行测序。 　　1.2.2 pLXSNIRES2EGFPGDNF重组体的构建