张新祥《生化分析》0422GFP-林若韵.pdfVIP

绿色荧光蛋白 Green Fluorescence Protein 林若韵 2014. 4. 22 光稳定性强 灵敏度高 无需外源底物 …… The Nobel Prize in Chemistry 2008 for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Tsien “I decided to find out who the schnook was that won this year’s prize. So I opened up my laptop and found out I was the schnook.” ——Martin Chalfie GFP的发现与提取——下村脩  最早在北太平洋寒冷水域的水母Aequorea victoria中发现  下村脩：“在日光下是稍稍发绿的，但在钨灯下则为黄色， 在紫外光下则呈现出很亮的、绿色的荧光”  与发蓝光的钙结合蛋白水母素（Aequorin ）通过荧光共振能 量转移发出绿色荧光  395 nm、475 nm激发，509 nm发射 GFP在线虫中的表达——Martin Chalfie  Douglas Prasher 1992年克 隆出GFP的cDNA  Martin Chalfie将GFP的基因 片段与线虫蛋白基因融合，使 GFP成功在线虫体内具有时间、 空间分辨性地表达  该工作于1994年发表，并引 起轰动 GFP的发光机理与变体设计——钱永健  研究了GFP的晶体结构  探明GFP发光机制原理  设计并合成了不同光谱性质的GFP变体 GFP与传统生物发光特点比较 传统生物发光 GFP发光  通过荧光酶与荧光素发光  自催化形成发光基团  具有物种专一性  可在其它生物中表达  难以通过基因工程操纵  易通过基因工程操控  酶催化信号放大  荧光灵敏度高 GFP的晶体结构 “Light in a can”  长4.2 nm ，宽2.4 nm  11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠形成圆柱形水桶样结构  桶顶部由三个短的垂直片段、底部由一个短垂直片段覆盖  一个α螺旋片段穿过桶部连接桶内部的发色团  桶结构保护发色团不受氧或氢离子猝灭  桶结构不完整会导致GFP失去荧光 GFP发色团的形成  翻译后通过Ser65-Tyr66-Gly67自催化环化形成 GFP发色团的三维结构 发色团周围的氨基酸残基也对发色团的形成起到辅助作用，如Arg96激活 Ser65的羰基碳，使Gly67的N更易于进攻。 桶结构也限制了Ser65与Gly67上C与N的空间距离，促进环化。 GFP变体 作业 请画出GFP发色团的结构式