重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶融合蛋白复性条件的研究.pdfVIP

氨 基 酸 和 生 物 资 源 ????，?????：??～ ??? ??? ????? ? ???????? ?“????? 重组 ?一天冬氨酸—?脱羧酶融合蛋 白复性 条件 的研究? 郑 向 丽 ，林 陈 水? ?浙 江工 业大 学 药 学 院 ，浙江 杭州 ???????? 摘 要 ：以本 实 验 室 构 建保 存 的 天冬 氨酸 脱 羧 酶 工 程 菌 为 研 究 材 料 ，通 过 基 因表 达 ，对 所 得 到 的 重 组 胞 内融 合 表 达 型 天 冬? 氨 酸 脱 羧 酶 蛋 白 进行 体 外 复性 研 究 ，考察 温 度 、复 性 液 的 ??、复 性 时 间 、复 性 液 种 类 等 因 素 对 重 组 天 冬 氨 酸 脱 羧 酶 体 外 复 性? 的影 响 。结 果 表 明 ：最 佳 复 性 液 为 ???．?的 ????—???缓 冲 液 ，在 ??? 温 时间 ???，温 度 ??℃下 ，复性 效 果 最 好 。另 外 一 些 ?? 能? 达 到 ?．?的 缓 冲 液 复 性效 果都 不如 ????—???缓 冲液 。? 关 键 词 ：?一天 冬 氨 酸 一?一脱 羧 酶 ；基 因表 达 ；复性? 中 图分 类 号 ：????? 文 献 标 识码 ：?? 文 章 编 号 ：????—????????????—????—??? ?一天冬 氨酸一?一脱 羧酶 ??—????????—???????????—? ?．?? 实验 方 法? ????，???．?．?．??，????是 迄 今 为 止 自然 界 中发 现? ?．?．?? ???融合 蛋 白的制备? 的唯一 氨基酸一?一脱 羧酶???，它 能催 化 ?—???脱 羧生? 挑 取基 因 工 程 菌 ?．??????????????／?????一? 成 ?一丙氨 酸 。 目前 已用来 生产 ?—???以及拆 分 ???一? ????—??????—???单 菌 落 ，接 入 含 有 ?????· ?? ???生 产 ?—???。???也 是 一 种 多功 能 酶 ，它 除 了? ???的 ??培养 基 中 ，??℃ ，?????· ???? 振 荡 过? 可 以催 化 ?一天 门冬氨 酸 的脱 羧外 ，还 可 以催化 ?一半? 夜 ，按照 ?? 的接 种量 转接 于含有 ?????· ?? ???? 胱氨酸 亚磺 酸 的脱 硫作用 ，可 以催 化 ?一氨基 酸 和 ?一? 的 ??培 养 基 中 ，??℃ ，?????· ???? 振 荡 培 养 至? 酮酸 的转氨 基作 用 ，可 以与 ????—?丙 氨酸 发 生消 除? ??。。。? 为 ?．?时 ，添加 终浓 度为 ?．??????· ?? 的? 反应 ，从而 产生氯 离子 ，氨气 和丙酮 酸盐 。? 异 丙基一?一?一硫代 半乳糖 苷 ????? ?，??。?诱导 ???。? ???基 因 重 组 于 ???? 的下 游 ，可 在 ??培 养? ???????· ???? 离 心 ??????收 集菌 体 ，用 ????．?，? 基 中获得 高 效 可 溶 性 表 达 ，但 是 不 具 生 物 学 活 性 。? ???????· ?? ????—???缓 冲液重悬 后 进 行超 声 破? 在 此基础 上对其 进 行 复性 的研 究 ，旨在 获 得 高 活性? 碎 ?超 声 ???，间 隔 ???，重复 ???次 ?。细 胞破碎 液在? 的天冬氨 酸脱 羧酶 的条件