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PAGE  PAGE 15 实验一 根系活性的测定 1．原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。根对α-萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。 α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定α-奈胺含量。 2.药品： 40ppm（ug/ml）α-萘胺溶液：精确称取0.10g分析纯α-萘胺，先用2ml95%酒精溶解，加约50ml蒸馏水移入100ml容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。 １％对氨基苯磺酸溶液：称1ｇ对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。 100ppm亚硝酸钠溶液：称0.10g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。 0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液 分子量 0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ） Ｎa2HPO4.2H2O 178.05　　　 7.1184g Ｎa2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g KH2PO4 136.09 3.6292g Ｎa2HPO4.2H2O 7.1184g (或Ｎa2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中。 3.方法与步骤： α-萘胺标准曲线的绘制：用40ppmα-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm 各浓度α-萘胺的配制：用40ppm溶液配制 浓度５ppm10ppm20ppm30ppm40ppm40ppmα-萘胺(ml)5 10 20 30 40蒸馏水 35 30 20 10 0 α-萘胺标准曲线的绘制 试管号１（对照）２３４５６α-萘胺(ml)１（水）１１１１１磷酸缓冲液（ml）１１１１１１蒸馏水（ml）151515151515对氨基苯磺酸（ml）１１１１１１100ppm亚硝酸钠（ml）１１１１１１混匀，置室温（20~25度）下５分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml, 摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为０，读取光密度，以α-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。 将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的α-萘胺溶液和磷酸缓冲液各25ml，混匀。 静置5-10分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。将其余的溶液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25℃下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL溶液放入另一刻度试管，因为α-萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根，α-萘胺溶液的氧化量会意外增加）。 在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml，混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出α-萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些）。 结果计算 根系对α-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算 Y=[（A-B）-（C-D）]*E/（t*W） 式中：A-第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应； B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的α-萘胺浓度（ug.ml-1）。A-B即α-萘胺氧化总量； C-第一次空白测定值（ug.ml-1）； D-第二次空白测定值； C-D即α-萘胺自发氧化量； E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）； t-3小时； W-样品鲜重（也可以用干重计算）； 实验二、 硝酸还原酶活性的测定 -活体法 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可