肝糖原的提取、鉴定与定量-实验报告-第四实验室.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 2015级护理本科 组 别：  FORMTEXT
第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期2016-12-20实验地点 FORMTEXT
第四实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 2、了解离心管和分光光度计使用的原理并掌握操作步骤。 3、熟悉吸量管、可调式微量移液器的操作步骤。 4、熟悉溶液的转移操作；熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混 匀方法）。 5、了解呈色反应。 二、实验原理 (一) 肝糖原的提取与鉴定 1.糖原的分离 采用研磨匀浆使细胞破碎，用低浓度的三氯醋酸使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶从而使其沉淀，而糖原仍稳定保持在上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故用95%乙醇溶液将糖原沉淀，再用热水溶解。 2.糖原的鉴定 (1)糖原螺旋链吸附碘分子： 糖原水溶液呈乳样光泽，其长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子，呈现出红棕色。 (2)呈色反应——利用葡萄糖的还原性： ?CuSO4+2NaOH = NaSO4 + Cu(OH)2↓ ?2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖+ H2O ?2CuOH = Cu2O↓(红色) + H2O ④Cu(OH)2 = C u O ↓（黑色）+ H2O （二）肝糖原定量测定 1.糠醛衍生物的生成及其性质 糖原的水解产物葡萄糖可以在浓硫酸的作用下生成糠醛衍生物-5-羟甲基呋喃甲醛，其可以和蒽酮生成蓝色的化合物，该物质在620nm处有最大吸收。 2.标准对照法进行定量 糖含量在10μg～100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比，利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。 材料与方法： （一）肝糖原的提取与鉴定 1.实验材料：（1）样品：鸡肝 化钠溶液、班氏试剂、碘试剂 （2）试剂：5%三氯乙酸溶液、95％乙醇溶液、蒸馏水、浓盐酸、50%氢氧 （3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、研钵、试管、离心机、刻 度吸量管（移液管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、白瓷反应板、试管架、恒温水浴箱 实验流程 鸡肝约1.5 g，剪碎 ＋5%CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 ＋5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min） 沉淀（弃去） 上清（取3 ml） ＋3ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟 离心5分钟（4000 r / min） 上清（弃去） 沉淀 ＋蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟，溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml ＋浓HCl 5滴 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却 糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴 呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液 ＋班氏试剂4滴 混匀 沸水浴2分钟，观察变化 实验步骤 步骤 操作（1）肝匀浆准备称取肝组织约1.5g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨至乳状后，再加入5%三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。（2）提取糖原向上清液中加入等量的95%乙醇，混匀，静置10min，离心5min（4000 r/min）。倾去上清液，白色沉淀为糖原。加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。（3）糖