第7章高效液相色谱资料.ppt

第七章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) ; 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 ;2．高效液相色谱法与气相色谱法 ;东晋名医葛洪的著作《肘后备急方》中的“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”，她意识到常用煎熬和高温提取的方法可能破坏了青蒿有效成分。 　　不出所料，改用乙醚低温提取后，研究人员如愿获得了抗疟效果更好的青蒿提取物。; (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点。目前高效液相色谱法得到广泛应用，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 ;第2节 高效液相色谱仪;梯度洗脱 通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。; ;2．进样系统 ;3 分离系统——色谱柱 ;4．检测系统 ; ; 第3节 高效液相色谱的固定相和流动相 ;1.表面多孔型固定相;2．全多孔型固定相 ; ;（二）流动相;(3)高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质将使截止波长值增加50-1OOnm。 (4)化学稳定性好。不能选与样品反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 ;第4节 高效液相色谱法的主要类型及选择; ;3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的要求是尽可能不与固定相互溶，而且极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非??性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。 ;（二）化学键合液相色谱法（CBPC） ;2．键合固定相的制备 （l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应： ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。 （2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下 ; 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制PH在4～8范围内。;（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下： ;3．反相健合相色谱法 ;4.正相键合相色谱法 ;5.离子性键合相色谱法 ; ;（三）液一固吸附色谱法(LSAC); ;2.固定相 ;3.流动相 ;(四）离子交换色谱法（IEC） ;1．离子交换原理 利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换： 阳离子交换： ; ; ;3．流动相 ;（五）尺寸排阻色谱法（SEC）; ;2．固定相 排阻色谱固定相可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。 凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 （1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。 （2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。 （3）刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。;3．流动相 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当