人教版选修3专题2第2节第二课时动物细胞融合与单克隆抗体(共47张PPT).pptVIP

第九章; 第一节 动物细胞融合概述;Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动物中发现细胞融合现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生可以分泌 预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。;二、动物细胞融合常用方法;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 ;抗体的结构与功能 单克隆抗体的制备和生产 单克隆抗体的改造和应用 ; 一、抗体的结构与功能;抗体是由B细胞受抗原刺激后分泌的蛋白质。 抗体分子：四条肽链组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。 结合区：抗体分子上有两个抗原结合区 可变区（V区） 稳定区（C区）; 人体内的五种抗体;; 二、单克隆抗体的制备;The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies;单抗的制备过程;; 1.动物免疫与亲本细胞的选择;淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大/小鼠; 2.细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备; 3.杂交瘤细胞的筛选;细胞融合的选择示意图;HAT选择系统;杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或者是胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一；HPRT-细胞的嘌呤核苷酸与TK-细胞的嘧啶核苷酸只能由全合成途径产生。 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。 ;嘌呤核苷酸合成通路的阻断;淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT-或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。 ; 4.抗体阳性杂交瘤细胞的筛选;; 5.抗体阳性杂交瘤细胞株的克隆化培养;有限稀释法;软琼脂培养法; 6.单克隆抗体的大量制备和冻存;动物体内诱生法制备单克隆抗体纯化具体方法及过程 1、澄清和沉淀处理 小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，首先用离心力1000g离心5min，去除残留的小颗粒物质；再用0.2?m的微孔滤膜过滤除掉污染的细菌、支原体和脂质；最后用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单抗。 2、分离 主要分离方法包括凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。; （1）凝胶过滤 用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化。 常用Sephadex G200作分离介质，可收集到三个峰最高峰为IgM，另两个峰为IgG， 抗体回收率50%～80%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。 ; （2）阴离子交换层析 用于IgG类单克隆抗体的分离纯化。 在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度条件下洗脱下来，纯度较高。IgG2b、IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但纯度相对较低。在pH5.5条件下，把杂交瘤细胞培养上清液加到琼脂糖柱上时，所有抗体都能结合到柱上，而55%的杂蛋白可以被洗脱掉，再用不同离子强度的洗脱剂洗下。 在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析来分离单克隆抗体可以纯化25～100倍。高容量、高流速、化学稳定的新型离子交换剂适宜单克隆抗体的大规模纯化。 ; （3）亲和层析 多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体的纯化 IgG与蛋白A的结合与pH有密切关系，鼠源性单抗在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱IgG2a，pH6.0可洗脱IgG1。 用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。; 三、单克隆抗体的改造和应用;单抗作为体内体外诊断试剂;单克隆抗体靶向制剂;2）药物通过小