生物与分子生物学复习 第41章课件.pdfVIP

1第41章 基因工程及蛋白质工程 Chapter 41 Gene and Protein Engineering 2第一节 概 述 基因工程(Gene Engineering): 是对携带遗传信息的分 子进行施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表 达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工 项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建 重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体DNA技术 (DNA recombination)有时也就成为同义词。 蛋白质工程(Protein Engineering): 是在基因工程基础 上发展起来的。是指通过对蛋白质已知结构与功能的 认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技 术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。 3
1972年美国斯坦福大学的Berg和他的同事将λ噬 菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40 DNA中，首次构建出DNA的重组体。
1973年Cohen同时与S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核 糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆 菌，转录出相应的mRNA。 此研究成果标志基因工程的正式问世；并说明 了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因 导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到 原核生物细胞中并在其中实现功能表达。 41. 基因工程的准备阶段 (1) 理论基础:  在40-50年代确定了遗传信息的携带者，即基因的 分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的 物质基础问题。  在50年代揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保留复 制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。  在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和 操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明 了信息的流向和表达调控问题。 5(2) 技术基础:  20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的 发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。  在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交 技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应 用于基因操作实验。  70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。 以上这些技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决。  1972年首次构建了一个重组DNA分子，1973年将外源基因与 载体连接，得到了基因的分子克隆，并提出了体外重组的 DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效 表达等问题。  80年代PCR技术的发明使基因体外扩增发生了革命性变化。 6第二节 工具酶 DNA分子的剪切、重组、合成及修饰涉及 一系列酶促反应，催化这些反应的酶是基因操 作的基本工具，故又称为工具酶。工具酶在基 因克隆中占有非常重要的地位，只有了解其作 用机制后，才能加以灵活应用。 7用于核酸操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 反转录酶 8一、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 又称限制性内切酶，简称为限制酶。这类酶能识别 双链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯 链。 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA的入侵。1968年，Smith等人首先从流感嗜 血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III 。 9（一)限制酶的命名和分类 1. 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d （嗜血流感杆菌d株） H i n d II H i n d III 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 10 2. 限制性核酸内切酶的分类 主要特性 I 型 II 型 III 型 蛋白结构 限制修饰 辅助因子 识别序列 切割位点 双功能 异源三聚体 ATP Mg 2+ SAM TGAN 8 TGCT（Eco B） AACN 6 GTGC（Eco C） 距识别序列1 kb处 随机性切割 单功能 同源二聚体 Mg 2+ 旋转对称序列 识别序列内或附近 特异性切割 双功能 异源二聚体 ATP Mg 2+ SAM GAGCC CAGCAG 距识别序列下游 24-26 bp处 （二) II型限制酶的识别和切割位点 II 型限制性核酸内切酶的基本特性: 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部 分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序 列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome). EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5‘  G C T G A A T T C G A G  3’ 3‘  C G A C T T A A G C T C  5’ 5‘  G C T G