第十一章微生物的基本研究方法详解.ppt

第十一章 微生物的基本研究方法;教学目的要求： 掌握： 1、观察微生物所常用的光学显微镜分类、应用。 2、微生物单染色后的观察方法与活体的观察方法。 3、细菌的染色法及其应用，细菌单染色的原理、步骤。 4、从试管中采取菌体制备染色涂片的无菌操作过程。;一、观察微生物的常用设备 显微镜分为普通光学显微镜、电子显微镜等等，观察微生物的常用设备为普通光学显微镜。 *（一）、普通光学显微镜分类、应用 普通光学显微镜的分类： 低倍镜（放大倍数100左右） 应用：活性污泥菌胶团及生物相的观察等。;高倍镜（放大倍数400左右） 应用：霉菌、酵母菌等的观察、用血球计数板观察细菌等。 油镜（放大倍数1000左右） 细菌的观察等。 光学显微镜可用于观察微生物活体和死体。 （二）、电子显微镜 电子显微镜在微生物的研究中主要用于病毒及细菌微细结构的观察，如???毛等的观察。;电子显微镜观察的物体必须在真空和干燥的状态下进行，因而无法用来进行活体的观察。 因此，微生物的观察最常用的是光学显微镜（常简称显微镜）。 二、观察方法 *观察方法分为涂片染色观察法、活体观察法（压滴法）。 （一）、涂片染色观察法（微生物死体的观察）;细菌等微生物很小，而且都是无色半透明的，用普通显微镜放大，也只能粗略地看到其大小和形态。象鞭毛、荚膜等特殊结构更是看不清楚。因此要想观察清楚，就必须进行染色。 染色常用染料有美蓝、结晶紫、沙黄等碱性染料。 染色原理：细菌细胞内含有大量的蛋白质，其等电点较低，约在pH2~5之间，所以在中性、碱性或弱酸性溶液中细菌都是带负电的，碱性染料电离时染料离子带正电，容易与带负电的细菌相结合而使细菌着色。;染色的方法主要有：单染色法、复染色法两种。而用于细菌的芽孢、荚膜、鞭毛等的复杂染色法则不常用。 *（1）、细菌单染色法 单染色法只用一种染料使细菌着色,主要是帮助观察细菌的形状和大小，鉴别作用不大。常用染色液为美蓝、石炭酸品红等。 步骤及方法：P341; ①涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面的中央滴一小滴无菌水或生理盐，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量待染色的菌种与玻片的水滴混匀，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 活性污泥染色可用小液管取一滴活性污泥液于载玻片上铺成一薄层即可。 *下图为做涂片的无菌操作过程。;图11-1;②、干燥 最好在空气中自然风干，为了加快干燥速度，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。（正面向上） ③、固定 将已干燥的涂片正面向上，玻片于酒精灯的火焰中通过3~4次，以玻片与手接触面感到稍微烫手为度。 作用：一是使菌体固定于玻片上不易脱落，二是可使标本容易着色。 ;④、染色 在载玻片上滴加染色液（石炭酸品红或美蓝等），使染液铺盖涂有细菌的部位并持续一定的时间（石炭酸品红约1~2min，美蓝约3~5min，结晶紫1min ）。 ⑤、水洗 染色到达所需时间后，倾去染色液，将玻片稍倾斜，用细水流将涂片上的剩余染料洗去，直至水呈无色为止。水流切勿过急过猛，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。;⑥、吸干 将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠（注意勿将细菌擦掉）。 ⑦、镜检 待标本片干后置显微镜下，先用低倍镜观察，发现目的物后再用油镜观察。;（2）、细菌的复染色法（鉴别染色法） 细菌复染色法用两种染料使细菌着色，有鉴别作用，所以又称为鉴别染色法。如革兰氏染色法是常见的细菌复染色法，可以鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。 革兰氏染色法具体步骤及方法： ①涂片 ②干燥 ③固定（此三步同细菌的单染色）;④初染 加草酸铵结晶紫一滴染色约lmin，水洗。 ⑤、媒染 加碘液覆盖约lmin，水洗。 作用：进入菌体细胞内与结晶紫形成复合物，帮助染料与菌体蛋白结合。 ⑥、脱色（关键步骤）;斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置0.5~1min，水洗） ⑦、复染 用砂黄染液复染0.5min，水洗。 ⑧、吸干 用吸水纸吸掉水滴。（切勿擦拭）;⑨、镜检 待标本片干后置显微镜下，先用低倍镜观察，发现目的物后再用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。 革兰氏染色法的染色反应特征： ;（3）、复杂染色法 用于细菌的芽孢、荚膜、鞭毛等的观察。这部分在此不做介绍，详细可参阅微生物专书。 注意： 微生物经过染色以后，就已经被杀死。 用涂片染色法制作成的微生物标本片可直接观察，不用加盖玻片，可根据微生物的大小分别采用低倍镜、高倍镜及油镜。;（二）、微生物活体观察 微生物活体观察法有两种，压滴法和悬滴法，常用方法为压滴法 *1、压滴法 做法：取一小滴菌液或活性污泥液等，放在洁净的载玻片中央，用盖玻片覆盖后，即可以