裂解细胞的方法.docVIP

Welcome to DXY.CN Forum 论坛首页 | 全文有哪些信誉好的足球投注网站 | 电子期刊 | 个人属性 | 注销登陆 标记已读 | 我的论坛 | 我的简历 | 我要招聘 | 帖子收藏 | 论坛帮助  ??Welcome to DXY.CN Forum???蛋白质技术讨论版 ? 蛋白质技术讨论/FONT b ??打印话题 ?? 寄给朋友 ?? [原创]菌体/细胞裂解法汇总 ? [精华] KILLUAHUNTER 发贴: 35 积分: 2 得票: 7 状态: 离线 2005-12-06 23:11 由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。菌体/细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2url=http%3A//www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/200410/80878%2Ehtmlb=0a=3user=baidu2、至少3次以上冻溶。/bbs/actions/archive/post/3895899_0.html3、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。/bbs/actions/archive/post/252157_0.html4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻/dispbbs.asp?BoardID=89ID=142945replyID=597858skin=1二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。/bbs/actions/archive/post/3895563_0.html2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。/bbs/actions/archive/post/3895899_0.html3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。/bbs/actions/archive/post/1861187_0.html4、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法：冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。/bbs/actions/archive/post/1166442_0.html2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。/bbs/post/view?bid=65id=4936753sty=3keywords=SDS+%C1%D1%BD%E23、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。/bbs/actions/archive/post/2524891_0.html4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。/bbs/actions/archi