毕赤酵母高效电转化方法的探讨.PDFVIP

中国修复重建外科杂志 2002 年第 16 卷第 3 期 2·17 · 毕赤酵母高效电转化方法的探讨 张　艳　杨清武　 吕凤林 　　建立一种高效的毕赤酵母电转化方法, 探讨影响 法、 法、醋酸锂法和原生质法。 和醋酸锂法转 PEG PEG 转化效率的因素, 采用该方法可明显提高转化效率, 最 化效率较低, 每微克DNA 只有几十个转化子, 而原生 高可达到 3 300 个 , 明显提高 (转化生 质法费时, 不值得推荐使用。电穿孔法因简便、迅速, 在 gDNA T GF 长因子 ) 的表达量, 为研究创伤后的组织修复奠定 基因导入宿主细胞中广为使用, 但不同的转化方法对 [ 3 ] 基础。 转化效率影响非常明显 。利用毕赤酵母进行基因工 程表达蛋白质时, 建立一种简便、快速而有效的方法将 1　方法 外源基因导入酵母细胞显得极为重要。该法显示酵母 9 5 质粒按文献[ 1 ]构建, 毕赤酵母菌 菌OD 值在12～ 13 时可获得较高的转化效率; 证实 pP IC K C aR GS 115 (H is- M u t+ ) 和 KM 71 ( arg4 H is4 aox 1 ∷ 了不同的整合方式和不同的菌株对转化效率也有明显 ) 影响。我们认为在实验中根据相应的目的和要求来选 A R G4, Invitrogen 公司 ; 按文献[ 2 ] 的方法制备感受 态细胞, 以每 管 80 l 分装于- 80 ℃冻存备用; 将 取菌株和相应的整合方式, 并考虑上述由菌株和整合 9 质粒分别用 和 酶切, 方式的影响, 选取二者兼顾的菌株和整合方式。其次, pP IC K T GF Xm n Xba 取不同量的线性DNA 与冻存不同时间的感受态细胞 在一定范围内转化不同含量的质粒DNA 对转化效率 (取不同生长状态的菌珠 GS 115 或 KM 71, 即不同的 无明显影响, 提示在实验过程中通过加大DNA 含量 ) 来提高转化效率是不可取的; 我们的结果也提示酵母 OD 值 80 l 混合后, 转入预冷的 02 cm 的电击杯 (B ioR ad) 中, 并轻敲电击杯, 使混合物沉入电击杯底, 感受态细胞可在- 80 ℃保存 3 周不影响转化效率, 实 在 电转 化 仪 (B ioR ad ) 上进 行 转 化, 条 件 为: 电压 验中可一次大量制备感受态细胞分装保存, 且实