PCR技术将在临床检验领域迎来新契机.doc

PCR技术将在临床检验领域迎来新契机 来源：广东医学2010年2月第31卷第3期 周高英，叶锋 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司(北京100176) 1985年，Mullis发明的聚合酶链式反应(PCR)技术在医学界掀起了基因诊断技术的热潮，PCR技术凭借快速、简便、灵敏等优点以惊人的速度广泛应用于临床基因诊断等领域，成为现代医学发展的又一里程碑。但十多年的临床实践表明，PCR技术本身在工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR产品标准化等方面还存在着若干弊端，这导致检测结果上的差异，这已经成为当前困扰临床医师、实验室技术人员以及患者的普遍问题。本文将从PCR技术产业发展回顾、诊断试剂的标准化以及PCR技术在临床检验领域的新契机等3个方面进行阐述。 1 PCR技术及产业发展历史回顾 1985年，美国MULLIS等[1]发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，并依靠此项技术获得1993年诺贝尔化学奖。1989年，Hoffmann—La Roche公司和Cetus公司开始将PCR技术应用于临床诊断领域。1996年，美国Applied Biosystems公司推出全球首款实时荧光定量PCR技术，并在欧美各国悄然兴起 ，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点，因而在各级临床实验室得以迅速推广[3]。PCR技术于90年代中期在国内全面展开临床应用工作，但是由于传统的PCR技术本身存在着许多局限性(如产物不能准确定量、容易交叉污染、导致假阳性等)，在1998年遭到了卫生部门的明令禁止。此后，由于荧光定量PCR技术的出现以及国内外学者的不懈努力，政府相关部门于2002年颁布《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件，从制度上规范了PCR实验室运作，建立起有效的质量保障体系[4]。目前，已有多家国内外生产厂商涉足研发生产适用于临床诊断的PCR检测试剂盒，并在PCR产品市场中占得先机。经过多年的发展和完善，荧光定量PCR技术在国内科研、检测和诊断领域已得到广泛应用，无论是产品种类、产品质量、技术优势和市场规模均可与国外厂家相媲美，另外，由于试剂价格远低于进口产品，国产PCR诊断试剂占领了绝大部分国内市场份额。 2 临床PCR诊断试剂产品的弊端 临床实验室检验标准化并非单一因素，它由诸多关键性环节组成，其中工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR试剂产品标准化是PCR临床检验标准化的核心内容。目前国家颁布的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件从根本上规范了工作流程标准化问题；对PCR仪器标准化而言，一些进口PCR仪器依靠高度的稳定性、可重复性和高效的数据分析软件，已实现了实验数据的可靠性和标准化操作流程；由于价格占优，国产PCR诊断试剂占据了国内的大部分市场，但是由于不同的厂家缺乏统一的检查标准，往往使得同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果存在较大差异。这已经成为困扰临床医生、患者以及实验室技术人员的普遍问题，这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。目前对于PCR诊断产品标准化主要存在以下4个问题： 2.1 定量的目的和意义不明 除少数种类试剂外，目前已上市的大部分试剂盒并不是报告原始样本中病原体的浓度，而是核酸提取后产物的靶基因浓度，并不能真正反映原取材样本的靶基因的真正含量。选择合适的实验标本是减少实验误差的第一个过程，然而不同实验的实验样品并不具有通用性，很难确保实验样品的均一性。在人体，血液样本容易收集、相对恒定、能确保不同样本间的比较，对血液中病原体进行定量检测更精确且有实际意义。然而对于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、组织块等样本，由于采样时患者的生理状况和取样部位等因素，虽然用物理、化学或酶的方法对标本进行了处理，但仍然无法做到均一性和可比性，因此其所谓的定量仅仅是针对核酸提取物中靶基因定量。 2.2 定量的依据不妥据调查，目前市场上PCR定量试剂无一例外都采用质粒做为试剂盒定量标准。由于质粒是一种人为构建的脱氧核糖核酸载体，环状物理构象存在特殊性，和线性的基因组DNA相比，PCR扩增效率上具有差别。