第12单元 分子发光分析.pptVIP

第十二章 分子发光分析法 第一节　分子发光的概述 第二节　荧光和磷光分析 第三节　化学发光分析 什么是分子发光分析 荧光、磷光是怎么产生的（激发态如何回到基态） 荧光和磷光的区别 荧光定性分析基础（激发光谱、发射光谱） 荧光定量分析基础 荧光强度的影响因素 仪器构造 化学发光的原理和分类 第一节分子发光的概述 一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 二、分子荧光分析法的特点 1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度 2. 选择性好 　不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长 　不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长 　比较容易排除其它物质的干扰，选择性好 3. 实验方法简单 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 　具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。 　荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法 第二节　荧光和磷光分析 一、荧光磷光的产生 2.电子激发态的多重度 2.激发态→基态的能量传递途径 非辐射能量传递过程 辐射能量传递过程 二、荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。 磷光具有如下三个特点： （1）磷光辐射的波长比荧光长 （2）磷光的寿命比荧光长 （3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感。 三、激发光谱、发射光谱 1.激发光谱：固定测量波长为荧光的最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同。 2.荧光光谱：固定激发光波长为其最大激发波长，测定不同的波长下荧光或强度，即可绘制荧光强度随波长变化的曲线即发射光谱（荧光光谱）。 3.激发光谱与发射光谱的关系 镜像规则的解释 四、荧光效率及其影响因素 1.荧光效率：也叫量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示 ? = 发射荧光分子数 / 激发分子总数 ?= kf /（kf+?ki） 式中kf为荧光发射过程的速率常数，?ki为其它有关过程的速率常数的总和。 荧光效率越高，物质发射的荧光越强 对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明?kI很小，可以忽略不计。 一般来说，kf主要取决于化学结构，而?ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 2.荧光与分子结构的关系 ?共轭效应：共轭度越大，荧光越强。 ?刚性结构：分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。 如荧光素（?大）与酚酞（?=0）； 　芴（?=1）与联苯（? =0.18）。 螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。 如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。 3.环境因素对荧光的影响 溶剂效应： 溶剂极性增强使物质的荧光波长红移，荧光强度大。 温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度 或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。 pH值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构 可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。 表面活性剂：荧光物质周围形成胶束，提高荧光效率。 溶解氧：降低荧光效率。 五、荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率? 。 If = ? Ia 式中?为荧光量子效率，又根据Beer定律，当A0.05 If =2.3 ? I0 klc If = K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当?lc?0.05时才成立。 对于较浓溶液，由于猝灭