聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析.PDFVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析 在很多地方看到大家都在讨论关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的知识。看了好多观点以后，不如自己做一个实验 来分析。更何况对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析必须要通过实验来验证观点。下面就是关于聚丙烯酰胺凝胶 电泳实验分析： 明确实验目的： 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。 3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。 了解实验原理： 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr ）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合 交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所 带电荷的多少及分子大小。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续 pH 梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。由于垂直板形凝胶具有板薄、 易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳 的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-9～10-12g 样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分 子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的 测定分子量的方法。 不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用最广泛的凝胶电泳。不连续是指电泳的pH 值不连续（样品浓缩胶 缓冲液pH 6.8, 电极缓冲液pH 8.3, 分离胶pH 8.8）、凝胶不连续（一般分成样品浓缩胶和样品分离胶 两层）。变性是指样品蛋白经SDS 和巯基乙醇作用后，所有蛋白质都解聚成为其构成亚基，并且都带上负 电荷，形状都近似于长椭园棒状。这种SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有 电荷和形状的影响，而只与园棒的长度也就是蛋白质的分子量有关。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于灌制凝胶时聚丙烯酰胺的浓度和交联度，二者决定凝胶分子筛 的孔径大小，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺 所灌制凝胶的线性分离范围如下表： SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围（*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1 ：29） *丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 实验准备： 一、器材 1.垂直平板电泳仪全套。 2.刻度吸管、三角烧瓶、加样枪等。 二、试剂 1.30%丙烯酰胺/N, N’-亚甲双丙烯酰胺 以温热去离子水配制成含29% （w/v）丙烯酰胺和1% （w/v） N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，过滤后入棕色瓶中置4oC 冰箱贮存。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程 中会在光催化或碱催化下缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，故溶液的pH 值不亦超过7.0，且应免光保存。 一般在棕色瓶、4oC 冰箱条件下可保存数月。 小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 2.十二烷基硫酸钠（SDS） SDS 可用去离子水配成 10% （w/v）贮存液于室温保存。 3.TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰 胺的聚合，TEMED 原液可在4oC 冰箱保存。 4、10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。 注意：10%过硫酸铵必须新鲜配制，现用现配。 5.4×1.5mol/L Tris （pH8.8）贮存液（稀释4 倍即为分离胶缓冲液） 在300ml 去离子水中溶解91g Tris 碱（3mol/L），用1mol/L HCl 调pH 至8.8，加去离子水定溶至 500ml，滤纸过滤后置40 冰箱保存。 6.4×1 mol/L Tris （pH6.8）贮存液（稀释4 倍即为浓缩胶缓冲液） 在40ml 去离子水中溶解6.05g Tris 碱（0.5mol/L），用1mol/L HCl 调pH 至6.8，加去离子水定溶 至 100ml，滤纸过滤后置40 冰箱保存。 7.5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液（稀释5 倍即为Tris-甘氨酸电泳缓冲液） 在900ml 去离子水中溶解15.1g Tris 碱和94g