细胞工程：课件.pptVIP

科学家们是咋整的捏？ 有48只4~6周大的小白鼠（BALB/C）要遭殃了！ * 动物实验 帮我照顾好我七舅老爷… 肝门静脉注射 实验组 100μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 500μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 对照组 磷酸盐缓冲液 静脉注射 实验组 100μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 500μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 对照组 磷酸盐缓冲液 肌肉注射 实验组 100μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 500μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 对照组 磷酸盐缓冲液 口服 实验组 100μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 500μgTAT-β半乳糖苷酶蛋白 对照组 磷酸盐缓冲液 将小白鼠饲养在消毒过的笼子里，为给它们的食物和水都消过毒。 在注射后的15min，1h，6h，10h和24h后取出一定量的组织（肝脏、肾脏、脾脏、脑组织等）。 将取出的组织分成两份。一份冷藏在组织培养基中以待用5-Br-4-Cl-3-吲哚-β –D-吡喃型半乳糖苷（X-gal）染色；另一半保存在液氮中以待β-半乳糖苷酶的酶活分析和蛋白质杂交的定性鉴定。 TAT- β-半乳糖苷酶融合蛋白的纯化 TAT- β-半乳糖苷酶融合蛋白是将β-半乳糖苷酶的基因插入到编码TAT-血球凝集素蛋白的质粒中，再转导进细菌【BL21（DE3）LysS】后得到的。将转导后的细菌在Luria-Bertani培养基中培养一整夜。将500ml培养液中的菌体沉淀物加入到20ml冷藏后的磷酸盐缓冲溶液中，使之重新形成悬浊液，再转移到含有20mM的咪唑和多种蛋白酶抑制剂的10ml冷藏过的磷酸盐缓冲溶液中。用超声波降解细菌3次，每次15秒。将溶解物离心30min（4°C ，15000rpm）后，将上清液和10ml nickel-nitrilotriacetic acid agarose matrix混匀后装入Econo-column。先用50ml含有20mM咪唑的磷酸盐缓冲溶液洗涤层析柱后，再用5ml含有咪唑（100mM，250mM，500mM，1000mM，5M）和蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲溶液洗提。用凝胶染色确定流出液含有β-半乳糖苷酶后，用Centricon Plus-20PL Centrifugal Filter Device 浓缩流出液，再在G25 Sephadex mediam上用PD-10使之脱盐，摇匀后，用含有蛋白酶抑制 剂混合物的磷酸盐缓冲溶液洗提一次。以标准牛血清蛋白（0.5mg/ml~10mg/ml）为参照，将最终的洗提液电泳来确定最终的蛋白浓度。 注意：使用前，将TAT- β-半乳糖苷酶融合蛋白在4 °C 下保存，并加入牛血清蛋白，防止沉降。 X-gal着色 将取出的组织（心、肝、脾、肺、肾、肠、脑）在低温恒温器内切成12~15μm 的小段，用戊二醛浸泡并保存15min。漂洗后用磷酸盐缓冲液浸洗3次。用一支PAP-pen（免疫组化笔）在组织周围画圈（主要是为了避免液体的流失，具体的原理不知道）。用x-gal染色后，将组织在37 °C 培养16h。 用磷酸盐缓冲溶液清洗组织的切面两次。 将组织用0.1%Sirius Red F3B溶液复染。 在光学显微镜下观察组织切面。 β-半乳糖苷酶活力的分析 将一块6~8mm3的组织用300μl报告基因裂解缓冲液溶解后，离心10min（ 4°C ，13000g）。上清液的蛋白浓度用Bradford分析法分析。 在96孔板上，将100 μl的样品与100 μl的pH7.3的溶液（含有200mM磷酸钠，2mM氯化镁，100mM β-巯基乙醇，1.33mg/ml β -D-吡喃型半乳糖苷）混合后，在37 °C 下保存一小时。 根据样品在420nm的光吸收度与纯酶的标准吸收曲线的差异，确定样品中蛋白的浓度。 背景吸收的消除：将未被实验的小鼠的组织的提取物在420nm下测定吸光度。 蛋白质杂交分析 在磷酸盐缓冲溶液中，将收集到的小鼠组织超声波降解。 组织溶出物离心30min（ 4°C ，20000rpm）。 用Bio-Rad protein分析法确定上清液中的蛋白浓度。 将上清液与等体积的Laemmli样品缓冲液（0.25MTris-HCl，pH6.6，20%的β-巯基乙醇，4%的SDS）混合均匀。 加热到100 °C ，保持3min。 将加热后的液体离心5min（15000rpm）以除去不溶性物质，将上清液转移到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。 For immunostaining, the following primary antibody were used: rabbit anti-?-galactosidase (1/1200); The secondary